1、本實驗采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將商陸抗病毒蛋白(Pokeweedantiviralprotein，pAp)基因?qū)霟煵荩貌东@pBinARpap質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404與煙草葉片外植體共培養(yǎng)，并在附加30mg/LKan的MS＋0.1mg/LIAA＋1.5mg/LBA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株分化，生芽后在附加30mg/LKan+O.1mg/LNAA的MS培養(yǎng)基上生根，實現(xiàn)再生植株。經(jīng)過PCR檢測、PCR-Southern檢測、RT-PCR檢測

2、，綜合抗TMV病毒試驗結(jié)果，獲得能夠抵抗病毒侵染的工程植株.主要結(jié)果如下： 1.通過根癌農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法，用含pBinARpap質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404侵染煙草K326，同時選擇了合適的Kan濃度對轉(zhuǎn)化過的外植體進行篩選，經(jīng)共培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，最終得到抗性植株，分化出苗，獲得了45株抗卡那霉索的煙草植株，并全部移栽成活。 2.提取抗性植株葉片的基因組DNA，用設(shè)計的引物對45株植株進行PCR檢測，結(jié)果只有一株檢

3、測到大小1000bp的目的片段。為證實擴增條帶為目的產(chǎn)物，進行PCR-Southern檢測，將PCR電泳凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后用地高辛(DIG)標(biāo)記的PAPDNA探針進行雜交分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針與陽性植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物產(chǎn)生了強烈的雜交反應(yīng)，進一步證實了PCR擴增片段的確為PAP基因，雜交結(jié)果證明PAP外源基因已整合進煙草細胞核基因組中。 3.Trizol法提取陽性植株的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，質(zhì)粒DNA作為陽性對照，PCR