1、【研究背景】目前國內(nèi)外公認(rèn)有效抗HBV藥物仍然是干擾素-a和核苷類藥物，但其療程長，停藥后病情復(fù)發(fā)，容易導(dǎo)致HBV變異和耐藥；肝功能正常的慢性HBV感染療效差。所以尋求新的抗HBV藥物是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 PAP是從美洲商陸提取的一類單鏈廣譜抗病毒蛋白，可抑制艾滋病毒、單純皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒等多種病毒的復(fù)制。PAP除了使核糖體失活，達(dá)到抑制蛋白的合成或抗病毒作用外，還可以直接作用于病毒的核酸包括mRNA和DN

2、A，而抑制病毒復(fù)制。所以PAP的抗病毒機(jī)制是從病毒復(fù)制的各個環(huán)節(jié)。從理論上推測PAP可以抑制HBV復(fù)制的各個環(huán)節(jié)，是比較理想的抗HBV藥物。 由于PAP是一類蛋白，各個蛋白之間的基因差別較大，從商陸植物中很難獲得單一的PAP；對PAP基礎(chǔ)研究包括PAP的各功能區(qū)的位置所在，或探討功能區(qū)重要核苷酸的位置，將是以后研究的重要方面之一；天然的PAP具有除抗病毒作用外，還具有細(xì)胞毒作用，他們的功能區(qū)域在不同的位置，因此可以根據(jù)臨床應(yīng)用的

3、需要，改造PAP，所以PAP的變異體比天然的PAP更具有利用價值。本部分利用基因工程技術(shù)將PAP-a在原核和真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并在體外研究PAP對HBV的作用，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。 我們曾在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PAP-S可以抑制丙型肝炎病毒(HCV)的復(fù)制，其作用機(jī)制可能是抑制了HCV的轉(zhuǎn)錄和翻譯。為進(jìn)一步研究PAP在抗慢性肝炎病毒方面的潛能以及改造PAP使其更適應(yīng)抗病毒，所以本試驗(yàn)用基因工程的方法表達(dá)PAP，探討PAP基因治療方面的

4、應(yīng)用，研究PAP是否有抗HBV的作用。 【目的】構(gòu)建PAP-a基因的原核和真核表達(dá)載體，分別由大腸桿菌和真核細(xì)胞HepG2細(xì)胞表達(dá)PAP-a重組蛋白。PAP-a瞬時轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞，并將PAP-S作用于HepG2.2.15細(xì)胞，觀察PAP是否具有抗HBV的作用。 【方法】用PCR的方法，擴(kuò)增出PAP-a基因；并克隆到原核表達(dá)載體PQE-30質(zhì)粒和帶有綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotei

5、n，GFP)報告基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1中。以PCR和酶切方法篩選鑒定重組質(zhì)粒。最后經(jīng)測序證實(shí)各序列已完整無誤的插入PQE-30和pEGFP-N1中。將PQE-PAP-a轉(zhuǎn)化到E.Coli.M15，加入IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定PAP-a表達(dá)，SDS-PAGE對PAP-a初步分離，然后將PAP-a免疫家兔，收集血清獲得PAP-a的多克隆抗體。將pEGFP-PAP-a通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染

6、到HepG2細(xì)胞中，Westernblot檢測PAP-a的瞬時表達(dá)，熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步研究PAP對HBV的作用，用脂質(zhì)體的方法將pEGFP-PAP-a瞬時轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，確定PAP-a的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染后的72h收集標(biāo)本；另外將不同濃度的PAP-S作用于HepG2.2.15，分別于藥物作用的48、72h收集標(biāo)本。應(yīng)用ELISA、熒光定量PCR，細(xì)胞上清液的HBsAg、

7、HBeAg、HBVDNA水平的變化。 【結(jié)果】構(gòu)建的重組原核和真核載體經(jīng)酶切鑒定和DNA測序，表明PAP-a基因正確地插入PQE-30和pEGFP-N1中，且密碼子閱讀框正確。將PQE-PAP-a轉(zhuǎn)化到E.Coli.M15，加入IPTG1.0mmol/L誘導(dǎo)4h，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定PAP-a以包涵體的形似表達(dá)，其分子量約為30kDa，SDS-PAGE對PAP-a初步分離，免疫家兔獲得PAP-a的多克

8、隆抗體。pEGFP-PAP-a轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，在細(xì)胞中檢測到PAP-a基因片段，Westernblot可以檢測到PAP-a在HepG2細(xì)胞表達(dá)，用熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染pEGFP-PAP-a的HepG2.2.15細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的對照組之間，HBsAg、HBeAg、HBVDNA含量明顯差異。PAP-S作用于HepG2.2.15細(xì)胞，隨著PAP-S濃度、時間增加，對HBsAg和HBeAg抑制作用

9、逐漸增強(qiáng)；藥物作用72h時，各組上清液HBVDNA含量有明顯差異(P＜0.01)，并且隨著PAP-S濃度增加，HBVDNA含量明顯減少；在所試驗(yàn)濃度范圍1-10μg/ml內(nèi)，倒置顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，PAP-S為50μg/ml時，在倒置纖維鏡下發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞脫壁。 【結(jié)論】成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒PQE-PAP-a和pEGFP-PAP-a，經(jīng)序列分析證實(shí)序列無誤；PAP-a在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)；PAP-a蛋白免疫家兔，