1、黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物界的次生代謝產(chǎn)物，它對(duì)植物的生理生態(tài)功能具有重要作用，如花卉著色、紫外線防護(hù)、化感作用和病理防御。黃酮類化合物通過苯丙烷類途徑合成，并且該途徑上的大多數(shù)酶已經(jīng)被確定。黃芩是一種主產(chǎn)于亞洲的多年生草本植物，其根被作為傳統(tǒng)中藥用于炎癥和細(xì)菌性疾病的治療。在黃芩類中有幾種常用的藥用品種，包括正品黃芩和粘毛黃芩，它們的主要活性成分是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類化合物。近年的研究證實(shí)黃芩黃酮能抗艾滋病

2、毒和白血病毒，有助于治療乳腺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌等，還有清除自由基的功效。然而，關(guān)于黃芩黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵酶的信息還罕見報(bào)道。 在本研究中，通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)成功克隆了粘毛黃芩類黃酮生物合成途徑中三個(gè)關(guān)鍵酶基因：苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶和黃酮醇3—羥化酶。 克隆到一條苯丙氨酸解氨酶基因cDNA全長，命名為Svpal，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號(hào)FJ432698。Svpa

3、l全長2406bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個(gè)編碼2133bp的ORF，它編碼一條711個(gè)氨基酸殘基的PAL蛋白質(zhì)，預(yù)測分子式為C3405H5447N949O1038S28，分子量為77.180kDa，等電點(diǎn)為5.97。TargetP分析結(jié)果顯示SvPAL定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，且無轉(zhuǎn)運(yùn)肽。ProtScale預(yù)測SvPAL是疏水性蛋白質(zhì)。通過GOR預(yù)測SvPAL的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SvPAL含有43.88％的α—螺旋，12.

4、10％的延伸鏈和44.02％的無規(guī)則卷曲。分析SvPAL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，SvPAL，亞基包含多個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，如MIO位點(diǎn)等。用Neighber—joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，SvPAL很清楚地和其他植物中的PAL合為一簇，從分子水平上驗(yàn)證了所選植物的PAL可能起源于同一個(gè)祖先。 克隆到一條查爾酮合成酶基因cDNA全長，命名為Svchs，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號(hào)EU386767。Svpal全長16

5、49bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個(gè)編碼1170bp的ORF，它編碼一條390個(gè)氨基酸殘基的CHS蛋白質(zhì)，預(yù)測分子式為C1898H3012N506O565S19，分子量為42.566kDa，等電點(diǎn)為5.79。TargetP分析結(jié)果顯示SvCHS定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，且無轉(zhuǎn)運(yùn)肽。ProtScale預(yù)測SvCHS是疏水性蛋白質(zhì)。通過GOR預(yù)測SvCHS的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SvCHS含有37.44％的α—螺旋，18.97％的延伸

6、鏈和43.59％的無規(guī)則卷曲。分析SvCHS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，SvCHS亞基包含多個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，如丙二酰CoA結(jié)合位點(diǎn)、CHS催化中心等。用Neighber—joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，SvCHS很清楚地和其他植物中的CHS合為一簇，從分子水平上驗(yàn)證了所選植物的CHS可能起源于同一個(gè)祖先，也反映出黃酮化合物為聚類指標(biāo)的進(jìn)化生物學(xué)意義，從而說明類黃酮代謝關(guān)鍵酶的CHS蛋白在自然演化進(jìn)程中的遺傳保守性和功能穩(wěn)定性。

7、克隆到一條黃酮醇3—羥化酶基因cDNA全長，命名為Svf3h，并登錄到Genbank獲得了基因序列登錄號(hào)FJ432699。Svf3h全長1317bp，包括5’和3’非翻譯區(qū)、polyA尾巴和一個(gè)編碼1050bp的ORF，它編碼一條350個(gè)氨基酸殘基的F3H蛋白質(zhì)，預(yù)測分子式為C1751H2732N474O524S18，分子量為39.382kDa，等電點(diǎn)為5.41。TargetP分析結(jié)果顯示SvF3H定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，且無轉(zhuǎn)運(yùn)肽。Prot

8、Scale預(yù)測SvF3H是疏水性蛋白質(zhì)。通過GOR預(yù)測SvF3H的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SvF3H含有31.43％的α—螺旋，22.29％的延伸鏈和46.29％的無規(guī)則卷曲。分析SvF3H蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，SvF3H亞基包含多個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，如Fe2+結(jié)合位點(diǎn)和2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)等。用Neighber—jioining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，SvF3H很清楚地和其他植物中的F3H合為一簇，從分子水平上驗(yàn)證了所選植物的F3H可能起源于同