1、蘿卜(RaphanussativusL.)是一種重要十字花科蔬菜作物，具有較高的食用和藥用價值。硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）中的4-甲基亞磺酰丁基硫苷(Glucoraphanin，RAA)的水解產(chǎn)物蘿卜硫素(Sulforaphane，SF)是到目前為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最強的活性物質(zhì)之一。硫苷是十字花科蔬菜中的一類重要次生代謝產(chǎn)物，硫苷及其降解產(chǎn)物具有抗蟲、影響風(fēng)味和抗癌等作用。近年來隨著對擬南芥和白菜基因組全序列測定的完成，人們對硫苷

2、的生物合成代謝途徑及相關(guān)重要基因有了較為深入的了解，但是目前未見在蘿卜中有關(guān)硫苷合成調(diào)控基因的報道。本論文克隆了脂肪族硫苷合成代謝過程中相關(guān)重要基因序列及其啟動子序列，并對其中部分基因在蘿卜中的表達特性進行了初步研究，以期通過基因改良工程或表達調(diào)控手段選育高硫苷含量的蘿卜新品種奠定理論基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.利用電子克隆法從十字花科蔬菜蘿卜中分離獲得硫苷合成代謝過程中RsBCAT4、RsUGT74B1、RsGS-OX

3、1的3個關(guān)鍵基因序列。將得到基因的開放閱讀框序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已公布相應(yīng)序列進行同源性比較構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。另外利用半定量及熒光定量PCR技術(shù)研究其在不同發(fā)育時期（不同部位）的表達情況;此外，利用熒光定量PCR技術(shù)對不同處理（傷害，MeJA）下的蘿卜葉片進行表達分析。結(jié)果表明RsBCAT4在幼苗期（葉、莖、根）均表達，在膨大期和成熟期根部基本不表達，RsUGT74B1在幼苗期、在膨大期和成熟期表達量均很低，RsGS-

4、OX1在正常情況下表達量很低，但這三個基因在WO、MeJA處理后表達量均明顯增大。
　　2.利用電子克隆法分離獲得RsCYP79F1、RsCYP83A1、RsSUR1和RsSOT18基因的cDNA及DNA序列;同時應(yīng)用染色體步移法分離獲得這四個基因的啟動子序列。用PLACE、PlantCARE在線預(yù)測工具分析表明:其序列舍有啟動子特定調(diào)控元件（如TATA-box，CAAT-box等），還有一些順式調(diào)控元件（如MYB結(jié)合位點、ABA

5、響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件等）和一些其它調(diào)控元件，這說明這四個基因的表達可能受這些因素的調(diào)控。
　　3.利用電子克隆法分離獲得RsMyr1和RsMyr2基因cDNA及DNA序列;同時利用染色體步移法分離獲得RsMyr2基因啟動子序列。用PLACE、PlantCARE在線預(yù)測工具分析表明:其序列舍有啟動子的特定調(diào)控元件，（如CAAT-box，TATA-box等），還有一些順式調(diào)控元件（如MYB結(jié)合位點、AB

6、A響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件）和一些其它的調(diào)控元件，說明蘿卜RsMyr2基因的表達可能受這些因素調(diào)控;另外將RsMyr1和RsMyr2基因成熟編碼區(qū)（去除信號肽）連接到表達載體pET-30α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后誘導(dǎo)重組蛋白的表達。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進行SDS-PAGE電泳，產(chǎn)生了比預(yù)期大約8％的重組蛋白。最后構(gòu)建了RsMyr2的過表達載體。研究結(jié)果為評價蘿卜黑芥子酶分子特征和生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。