1、目的:血管平滑肌細(xì)胞膜上的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channels，BKca)在血管舒縮調(diào)控機制中起著重要的作用。平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上三磷酸肌醇受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)和蘭諾定受體(ryanodine receptors，RyRs)介導(dǎo)的Ca2+釋放可引起細(xì)胞內(nèi)局部[ca2+]i顯

2、著增加，激活鄰近胞膜上BKCa通道的開放產(chǎn)生自發(fā)性瞬時外向電流(spontaneous transient outward currents，STOCs)，進(jìn)而引起細(xì)胞膜超極化，電壓依賴性Ca2+內(nèi)流減少，負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。目前多數(shù)研究已證實在血管平滑肌中，RyR介導(dǎo)的鈣釋放是激活BKca通道開放產(chǎn)生STOCs的最終通路，而作為胞內(nèi)第二信使的三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3)與甘油二酯(

3、diacylglycel，DG)在對BKca通道的調(diào)控中也發(fā)揮了重要作用。前期研究已證實在inside-out膜片下，IP3對豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BKca通道的單通道活性具有激活作用；在全細(xì)胞構(gòu)型下，三磷酸尿嘧啶核酸(uridine5'-triphosphate，UTP)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的IP3與DG參與了STOCs的調(diào)節(jié)，并具有重要的生理意義。由于單通道記錄方法中，細(xì)胞貼附式(cell-attached)對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)在環(huán)境的干擾最小，

4、在該膜片形式下記錄到的單通道的活動較其它形式更接近生理條件；因此本實驗采用單通道膜片鉗技術(shù)，在cell-attached膜片上，進(jìn)一步研究UTP對急性酶分離的豬冠脈平滑肌細(xì)胞BKca通道的作用，并探討生理條件下UTP誘導(dǎo)產(chǎn)生的IP3對BKca通道的作用及其機制，為深入研究血管舒縮及調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。方法:分離新鮮豬心的冠狀動脈血管的二級分支，縱向剖開并斜行剪成2mmx5mm的組織條塊，置于酶液中進(jìn)行兩步法消化。選取貼壁良好，折光性強

5、，具有較強立體感，表面光滑的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實驗。取細(xì)胞置于對稱性高鉀溶液([K+]o:[K+]i=140:140mM)中，用膜片鉗技術(shù)記錄單通道電流，所得電流通過膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大，濾波(1KHz)后輸入計算機，用pCLAMP9.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。將膜電位鉗制于+40mV，在cell-attached膜片上觀察BKca通道電流的變化。實驗方案如下:①研究UTP對BKca通道的作用。②用UTP預(yù)處理細(xì)胞后，加

6、入磷脂酶C(phospholipase C，PLC)抑制劑U73122，探討PLC在UTP調(diào)控BKca通道中的作用。③加入PK.C特異性激動劑PMA；而在另一組實驗中用UTP預(yù)處理細(xì)胞，再加入PKC特異性抑制劑Bis-I，研究DG/PKC信使通路對UTP調(diào)控BKca通道的影響。④加入IP3R特異性抑制劑2APB，進(jìn)一步研究IP3/ca2+通路在UTP調(diào)控BKca通道活動中的意義。⑤記錄了藥物作用前后的通道電流后，灌流浴液5-7次，待通道

7、電流變化穩(wěn)定后，在cell-attached膜片基礎(chǔ)上形成inside-out膜片，并在此膜片上觀察和鑒別BKca通道的特性。結(jié)果:1. 在對稱性高鉀溶液中，在inside-out膜片上，豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電導(dǎo)值為229.5±8.1pS(n=20)，通道具有電壓依賴性和鈣敏感性，以及明顯的鉀離子選擇性，400nM的ChTX能夠完全阻斷通道活動。2.在cell-attached膜片上，80μMUTP可明顯激活BKCa通道:B

8、KCa通道開放概率增加，關(guān)閉時間縮短(P<0.01，n=21)。3.UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞之后，再向浴液中加入磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122(10μM)可使通道開放概率減小，通道開放時間縮短，關(guān)閉時間延長(P<0.05，n=5)。4.浴液中加入PKC激動劑PMA(10nM)，BKCa通道開放概率明顯降低((P<0.05，n=6)。5.用UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞，再向浴液中加入PKC特異性抑制劑Bis-I(1μM)，BKC

9、a通道開放概率較加入前明顯增大(P<0.05，n=6)。6.用UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞，再向浴液中加入IP3R抑制劑2APB(80μM)， BKCa通道開放概率降低，通道活動受抑制(P<0.05，n=6)。結(jié)論:1.在cell-attached膜片上，UTP能激活豬冠脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道。2.UTP對BKCa通道的激活作用是通過胞內(nèi)PLC信使轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。3.激活DG/PKC通路中的PKC可以在一定程度上抑制UTP對BKCa通