ET-1和CGRP對大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分內(nèi)皮素-1對大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響及機(jī)制研究研究 目的:通過ET-1作用于大鼠VSMC及對ET-1受體信號的阻斷,探討ET-1對VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響及機(jī)制。 研究方法:體外培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,實驗取第4~5代細(xì)胞。 實驗一,實驗分為:A<,1>:對照組、B<,1>:ET-1組、C<,1>:ET-1+BQ123.組。用無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后,各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物(

2、ET-1,10<'-7>mol/L:BQ123,10<'-6>mol/L),作用48h后收集細(xì)胞,用5.BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況;RT-PCR檢測’VSMC增殖負(fù)性調(diào)控基因HRG-1和表型標(biāo)志基因SM22a的表達(dá)。 實驗二,實驗分為:A<,2>:有血清培養(yǎng)72h組;B<,2>:無血清對照組;C<,2>:ET-1組;D2:ET-1+BQ123組。用無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后,各組細(xì)胞換用含10%NCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)

3、72h,此時A<,2>組終止培養(yǎng)收集細(xì)胞,其余各組換成無血清培養(yǎng)液并分別加入相應(yīng)藥物(ET-1,10<'-7>mol/L;BQ123,10<'-6>mol/L)作用48h,收集細(xì)胞,RT-PCR檢測HRG-1和SM22a mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:實驗一:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,ET-1作用組可見大量增殖的VSMC,而加入ET-1受體阻斷劑BQ123后標(biāo)記的增殖細(xì)胞顯著減少。RT-PCR檢測中,ET-1組HRG-1和SM22a mRNA

4、表達(dá)較對照組有明顯下調(diào),而加入阻斷劑BQ123可拮抗這一作用。實驗二: RT-PCR檢測進(jìn)一步證實BQ123有阻斷ET-1下調(diào)VSMC HRG-1和SM22a兩個基因表達(dá)的作用。 結(jié)論:1.ET-1對收縮型VSMC有明顯的促增殖作用,并可使VSMC表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化;2.ET-1對合成型VSMC同樣有促表型轉(zhuǎn)化和增殖的作用,表明ET--1對VSMC的作用是一種不可逆的因素。3.受體信號途徑是ET-1促VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖

5、的作用機(jī)制之一。 第二部分內(nèi)皮素-1與CGRP共作用對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響研究 目的:通過ET-1與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRF),共同作用于VSMC,研究CGRP抑制ET-1促VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖的作用及機(jī)制。研究方法:體外培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,實驗取第4~5代細(xì)胞。 實驗一,實驗分為: a<,1>:對照組;b<,1>:ET-1組;c<,1>: ET-1+CGRP組(ET-1作用24h后,再加C

6、GRP);d<,1>:CGRP+ET-1組(CGRP作用24h后,再加ET-1)。無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后,各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物(ET-110<'-7>mol/L;CGRP,2x10<'-7>mol/L),作用48h后收集細(xì)胞,用5-BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況,RT-PCR檢測HRG-1和SM22a mRNA的表達(dá)。 實驗二,試驗分為:a<,2>:血清培養(yǎng)72h組;b<,2>:無血清對照組;C<,2>: ET-1組;

7、d<,2>:ET-1+CGRP組(ET-1作用24h后,再加CGRP);e<,2>:CGRP+ET-1組(CGRP作用24h后,再加ET-1)。無血清DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后,各組細(xì)胞換用含10%NCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72h,此時a<,2>組終止培養(yǎng)收集細(xì)胞,其余各組換成無血清培養(yǎng)液并分別加入相應(yīng)藥物(ET-1 10<'-7>mol/L;CGRP,2x 10<'-7>mol/L)作用48h,收集細(xì)胞,RT-PCR檢測HRG-1

8、和SM22a mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:實驗一:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,ET-1組有大量標(biāo)記的平滑肌增殖細(xì)胞,加入CGRP后增殖細(xì)胞稍微有所減少,而先加CGRP作用組中增殖細(xì)胞數(shù)量大大減少。RT-PCR檢測中,ET-1組較對照組VSMC HRG-1和SM22a基因表達(dá)顯著下調(diào):加入CGRP兩基因表達(dá)有所上調(diào),但不明顯;而現(xiàn)加CGRP作用組中兩種基因表達(dá)上調(diào)明顯。實驗二:RT-PCR檢測進(jìn)一步證明,CGRP可阻斷ET-1下調(diào)VSMC HR

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