1、已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，人巨細(xì)胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)宮內(nèi)感染垂直傳播及母體內(nèi)血清鋅缺乏均可導(dǎo)致新生兒頭小畸形、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、血小板減少癥、聽(tīng)力漸進(jìn)性損傷及智力障礙等遲發(fā)性中樞神經(jīng)出生缺陷，嚴(yán)重影響嬰幼兒的健康質(zhì)量。 巨細(xì)胞病毒大多數(shù)在臨床上呈不顯性或潛伏感染的特點(diǎn)，已有研究表明，病毒基因組在潛伏期只限于表達(dá)立即早期的基因產(chǎn)物，巨細(xì)胞病毒立即早期基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受CMV增強(qiáng)子調(diào)控，巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子

2、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及可結(jié)合蛋白的多樣性可能有利于巨細(xì)胞病毒在不同細(xì)胞類型(分化、未分化)及生理?xiàng)l件下繁殖。近年來(lái)，機(jī)體微量元素鋅缺乏與病毒感染之間的關(guān)系及其機(jī)制逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，提出了微量元素鋅與病毒基因的復(fù)制密切相關(guān)，與病毒感染后機(jī)體的預(yù)后密切相關(guān)，但鋅與病毒之間的具體作用位點(diǎn)和機(jī)制尚不清楚，因此，本課題就微量元素鋅與巨細(xì)胞病毒之間的相關(guān)性設(shè)計(jì)了細(xì)胞、動(dòng)物模型和臨床等四個(gè)部分的系統(tǒng)研究，旨在揭示巨細(xì)胞病毒感染合并缺鋅導(dǎo)致出生缺陷的作用

3、機(jī)理。 研究的第一部分用巨細(xì)胞病毒感染不同鋅濃度的細(xì)胞，從觀察細(xì)胞的超微形態(tài)、細(xì)胞的病毒感染率、細(xì)胞線粒體膜電位的改變、凋亡因子的變化及細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡率等方面來(lái)探討細(xì)胞內(nèi)不同濃度鋅水平時(shí)對(duì)巨細(xì)胞病毒感染率及對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制；在第二部分用含有CMV立即早期基因增強(qiáng)子及啟動(dòng)子帶熒光素酶(Luciferase，LUC)報(bào)告基因表達(dá)的pRL-CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同鋅濃度水平的細(xì)胞，觀察其轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)一步來(lái)探討鋅作用于巨

4、細(xì)胞病毒的具體部位及細(xì)胞內(nèi)鋅處于不同水平時(shí)對(duì)巨細(xì)胞病毒立即早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用；在第三部分建立宮內(nèi)巨細(xì)胞病毒感染合并缺鋅的動(dòng)物模型，觀察出生后的小鼠腦干誘發(fā)聽(tīng)覺(jué)電位的變化、耳蝸組織的病理改變、相關(guān)因子的變化，探討巨細(xì)胞病毒感染合并缺鋅可能產(chǎn)生的出生缺陷及其作用于耳蝸的具體部位，揭示巨細(xì)胞病毒感染合并缺鋅所致的先天性耳聾的組織病理改變和發(fā)病機(jī)制；在第四部分通過(guò)臨床檢測(cè)巨細(xì)胞病毒感染的婦女體內(nèi)血清鋅值含量、觀察巨細(xì)胞病毒感染

5、者加用補(bǔ)鋅治療后的HCMV-IgM轉(zhuǎn)陰率、SOD、MDA的變化進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞內(nèi)鋅水平與巨細(xì)胞病毒感染的相關(guān)性、缺鋅對(duì)巨細(xì)胞病毒感染治療預(yù)后的影響及加用補(bǔ)鋅治療后HCMV-IgM轉(zhuǎn)陰率的觀察及其機(jī)制，從而為機(jī)體巨細(xì)胞病毒潛伏感染及激活導(dǎo)致先天性耳聾的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床進(jìn)行早期預(yù)防和治療，減少出生缺陷的發(fā)生率尋找新的突破口。 第一部分細(xì)胞內(nèi)不同鋅水平對(duì)巨細(xì)胞病毒感染宿主細(xì)胞線粒體介導(dǎo)凋亡的影響及分子機(jī)制 目的:T

6、PEN是一種鋅螯合劑，可以影響細(xì)胞內(nèi)的鋅水平。本文用巨細(xì)胞病毒感染不同鋅濃度水平的細(xì)胞，觀察細(xì)胞的超微形態(tài)、病毒感染率、細(xì)胞線粒體膜電位、凋亡因子及凋亡率，探討鋅對(duì)巨細(xì)胞病毒復(fù)制增殖的影響和細(xì)胞內(nèi)不同鋅水平對(duì)巨細(xì)胞病毒感染宿主細(xì)胞線粒體介導(dǎo)凋亡的作用及分子機(jī)制。 方法:用鋅含量終濃度為5μmol/L(缺鋅組)、20μmol/L(正常對(duì)照組)、40μmol/L(補(bǔ)鋅組)的培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)人胚肺細(xì)胞24h，分別加入100TCID50

7、的病毒干預(yù)72h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞病毒感染率；用電鏡觀察細(xì)胞的超微形態(tài)病變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率；共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞的線粒體跨膜電位(△ψm)；westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞Ctyc的表達(dá)；RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))檢測(cè)各組細(xì)胞bcl-2mRNA及baxmRNA的表達(dá)。 結(jié)果:(略） 結(jié)論:細(xì)胞內(nèi)不同鋅水平可以影響巨細(xì)胞病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染率，缺鋅時(shí)巨細(xì)胞病毒感染的細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、

8、Golgi復(fù)合體及線粒體等細(xì)胞器發(fā)生不可逆性損傷，細(xì)胞凋亡率增加。缺鋅還可加重巨細(xì)胞病毒感染的細(xì)胞線粒體膜電位耗散，bcl-2mRNA值下降，baxmRNA值增高，細(xì)胞色素C的釋放等線粒體介導(dǎo)的凋亡調(diào)控因子被激活，使CMV感染的宿主細(xì)胞發(fā)生不可逆性死亡；補(bǔ)鋅可以抑制巨細(xì)胞病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲，減少細(xì)胞器的損傷。通過(guò)保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的完整性、維持Bcl-2、Bax間的平衡和抑制凋亡通路中細(xì)胞色素C的釋放是其作用機(jī)制之一。

9、 第二部分細(xì)胞內(nèi)鋅水平對(duì)巨細(xì)胞病毒立即早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用 目的:巨細(xì)胞病毒立即早期等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受CMV增強(qiáng)子調(diào)控，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及可結(jié)合蛋白的多樣性可能有利于巨細(xì)胞病毒在不同細(xì)胞類型(分化、未分化)及生理?xiàng)l件下繁殖。本實(shí)驗(yàn)采用含有CMV立即早期基因增強(qiáng)子及啟動(dòng)子帶熒光素酶(Luciferase，LUC)報(bào)告基因表達(dá)的pRL-CMV質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同鋅濃度水平的細(xì)胞，用LUC報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析LU

10、C報(bào)告基因活性，觀察其轉(zhuǎn)染效率，旨在探討鋅作用于巨細(xì)胞病毒的具體部位及細(xì)胞內(nèi)鋅處于不同水平時(shí)對(duì)巨細(xì)胞病毒立即早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用。 方法:將生長(zhǎng)良好的WI-38人胚肺細(xì)胞換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，然后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺鋅組及補(bǔ)鋅組三組，分別加入TPEN、ZnCl2配制后鋅終濃度為20μmol/L、5μmol/L及40μmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。將pRL-CMV、pRL-SV40質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)

11、染于各組細(xì)胞，用LUC報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析LUC報(bào)告基因活性，觀察其轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果:（略） 結(jié)論:此研究結(jié)果提示鋅對(duì)巨細(xì)胞病毒的具體作用位點(diǎn)在即刻早期基因的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域，細(xì)胞內(nèi)鋅的水平調(diào)節(jié)著CMV即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的活性，這對(duì)整個(gè)病毒基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制表達(dá)起著非常關(guān)鍵的作用。 第三部分巨細(xì)胞病毒感染合并缺鋅導(dǎo)致先天性耳聾的作用機(jī)理 目的:在國(guó)內(nèi)外首次建立了CMV聯(lián)合鋅缺乏的

12、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討先天性耳聾與巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染及血清鋅元素缺乏之間的相關(guān)性，闡明兩種宮內(nèi)致畸因子所引發(fā)的親代妊娠結(jié)局的改變、其對(duì)耳蝸損傷的具體部位及導(dǎo)致先天性耳聾的致病機(jī)理，為先天性耳聾的診斷、早期防治提供理論依據(jù)。 方法:采用缺鋅飼料喂養(yǎng)和宮內(nèi)微型注射法建立CMV感染聯(lián)合鋅缺乏的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分為正常組、缺鋅組、病毒組、缺鋅合并病毒感染組四組，分別觀察每組的親代妊娠結(jié)局(流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎率及存活率)；腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位檢

13、測(cè)活胎仔耳聽(tīng)情況；原子吸收光譜法檢測(cè)胎鼠血清鋅含量；原位雜交確定CMV的感染和部位；病理組織學(xué)檢測(cè)耳蝸組織的病理改變；免疫組化檢測(cè)耳蝸NF-kB的表達(dá)。 結(jié)果:（略） 結(jié)論:本課題在國(guó)內(nèi)外首次建立了CMV感染聯(lián)合鋅缺乏的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，揭示了先天性耳聾與CMV宮內(nèi)感染及血清鋅缺乏之間的相關(guān)性，提示CMV和缺鋅是導(dǎo)致先天性耳聾的兩種致畸因子；研究還指出缺鋅合并CMV感染可加重聽(tīng)力的損傷，推測(cè)缺鋅合并CMV感染直接侵襲內(nèi)、外淋

14、巴可能是引起內(nèi)耳損傷造成先天性耳聾的機(jī)制之一；并探討了其作用機(jī)制，為臨床上早期診斷胎兒先天性耳聾的發(fā)病情況，及時(shí)給予對(duì)應(yīng)防治，降低出生時(shí)聽(tīng)力缺陷提供理論依據(jù)。 第四部分：應(yīng)用鋅防治巨細(xì)胞病毒感染的臨床價(jià)值研究 目的:探討機(jī)體巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染的預(yù)后與血清鋅含量之間的相關(guān)性，采用補(bǔ)鋅聯(lián)合中藥金葉敗毒顆粒治療巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染，探討加用補(bǔ)鋅治療對(duì)患者HCMV-IgM轉(zhuǎn)陰率提高的作用機(jī)理及臨床意義，為提高優(yōu)

15、生質(zhì)量開(kāi)辟新的治療途徑。 方法:采用ELISA法篩查血清中的HCMV-IgM陽(yáng)性患者，用火焰原子吸收光譜法測(cè)定其血清Zn值，并分別用中藥金葉敗毒顆粒及不同劑量補(bǔ)鋅治療，觀察其血清中的HCMV-IgM轉(zhuǎn)陰率、治療前后的血清SOD、MDA值的改變。 結(jié)果:（略） 結(jié)論:人體內(nèi)鋅水平對(duì)人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染患者的發(fā)病和療效均有顯著性影響，當(dāng)血清鋅值低于0.70mg/L時(shí)會(huì)對(duì)療效產(chǎn)生不利后果。合理補(bǔ)鋅聯(lián)合中藥金葉敗毒顆粒