1、背景：宮頸癌是世界范圍內(nèi)威脅女性生命的第二大惡性腫瘤。近年來(lái)，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡趨于年輕化。宮頸癌的發(fā)生是多基因參與的多步驟的病理過(guò)程，其前驅(qū)病變稱為宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，包含CIN I、CINII、CINIII(含原位癌)。CIN的發(fā)生與進(jìn)展存在著很多不確定因素，且臨床表現(xiàn)多樣性： (1)CIN I(低級(jí)別)中有20％病例可進(jìn)展為CIN

2、II/Ill(高級(jí)別)，50％-60％的可自發(fā)性消退；而40％-50％的CIN II/III可進(jìn)展為浸潤(rùn)癌。但細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)難以鑒別自發(fā)性消退或發(fā)展為浸潤(rùn)癌的病變。 (2)宮頸癌的發(fā)生與高危HPV感染有關(guān)。盡管大多數(shù)C1N患者有HPV感染，但僅有少數(shù)病例可發(fā)展為浸潤(rùn)癌。因此，緊密結(jié)合CIN病理診斷和臨床治療需要，評(píng)價(jià)促進(jìn)CIN發(fā)生與進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因子，使CIN分級(jí)更符合其生物學(xué)行為，以提高對(duì)CIN患者治療的合理性、治愈率和生活質(zhì)量，防

3、止對(duì)CIN過(guò)度治療或治療不足，對(duì)實(shí)現(xiàn)宮頸癌的早期防治具有重要意義。目的：研究CIN的克隆性特征及人乳頭瘤病毒HPVl6(human papillomaviroustypel6,HPVl6)E6基因整合狀態(tài)和P16蛋白表達(dá)情況，探討這些分子變化與CIN病理分級(jí)的相關(guān)性及其意義。 方法：從同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院病理科存檔的2000-2005年活檢或手術(shù)切除的宮頸標(biāo)本中，隨機(jī)選取150例，其中CIN I 33例，CINIl38例，CIN

4、III34例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)45例。另選取非宮頸病變切除的宮頸組織20例為對(duì)照組。所有標(biāo)本經(jīng)4％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，單個(gè)位點(diǎn)顯微切割病變組織及其間質(zhì)，常規(guī)方法抽提基因組DNA。 (1)巢式PCR擴(kuò)增位于人類X染色體上的.AR基因，PAGE電泳檢測(cè)病變的克隆性。 (2)以通用引物GP5＋/GP6＋擴(kuò)增HPVL1區(qū)；多重PCR同時(shí)擴(kuò)增HPVl6的E2、E6

5、基因，分析HPVl6的存在狀態(tài)。HPVl6 E2或E6陽(yáng)性提示HPVl6感染，HPVl6 E2/E6比值接近或大于1，為}tPVl6游離型；HPVl6E2/E6比值明顯小于1，為HPVl6游離、整合混合型；僅為HPVl6 E6陽(yáng)性，為}tPVl6E6完全整合型。 (3)免疫組織化學(xué)(Envision法)檢測(cè)P16在CIN的表達(dá)，分析其分布特征。 (4)采用SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：本組150例樣本中，成功擴(kuò)增1

6、39例，其中純合子12例，雜合子127例，雜合率91.4％。 結(jié)果： (1)各組病變單克隆率：對(duì)照組為0例、CINI組為26.9％(7/26)、CIN II組為51.5％(17/33)、CINⅢ組為82.1％(23/28)、SCC組為85.0％(34/40)，單克隆率隨CIN病變級(jí)別增高而增加(X2=16.492，P=0.0003)。 (2)各組HPVl6陽(yáng)性病變分別為：對(duì)照組2例、CIN I組8例、CINII

7、組13例、CINⅢ14例和SCC組29例；其中HPVl6E6的整合率分別為：正常組為0、CIN I組25％(2/8)、CIN II組30.8％(5/13)、C1NⅢ組64.3％(9/14)、SCC組79.3％(23/29)，HPVl6E6基因在各級(jí)CIN中的整合率不同，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X2=6.747，P=0.034)。HPVl6E6基因整合與CIN的單克隆性呈正相關(guān)(X2=7.768，P=0.0053，r=0.36)(3)P16在C

8、IN病變中表達(dá)程度不一，在CIN I、CINII和CINⅢ中的陽(yáng)性率分別為69.2％(18/26)、87.9％(29/33)和92.9％(26/28)，其差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=20.1，P<0.0001)。其中CIN I組有50％(13、26)的病變?yōu)镻16陽(yáng)性細(xì)胞的局灶分布，CIN II組有42.5％(14/33)的病變?yōu)镻16陽(yáng)性細(xì)胞在上皮基底旁連續(xù)分布，而CINⅢ組67.9％(19/28)的病變中P16陽(yáng)性細(xì)胞在上皮全層彌漫

9、分布，該分布特征差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=21.996，P<0.001)。SCC組P16陽(yáng)性率為97.5％(9/40)，其中90％(36/40)為P16彌漫陽(yáng)性。相關(guān)分析表明P16在各級(jí)CIN中的分布特征與HPVl6的整合有關(guān)(X2=4.36，P=0.037，r=0.37)。 結(jié)論： (1)單點(diǎn)顯微切割克隆性分析結(jié)果表明，本組病例中少部分CIN I、絕大部分CINII/Ill是單克隆性病變；發(fā)現(xiàn)單克隆性特征與CIN分級(jí)密切

10、相關(guān)，隨著CIN由低級(jí)別向高級(jí)別CIN進(jìn)展，單克隆性的發(fā)生頻率增加，提示單克隆性CIN具有腫瘤屬性。 (2)HPVl6E6基因整合與CIN分級(jí)相關(guān)，提示HPVl6病毒癌基因的整合參與CIN的發(fā)生與進(jìn)展，是宮頸SCC早期發(fā)生的關(guān)鍵步驟。 (3)P16在C1N中表達(dá)增高，且呈不同的分布特征，與CIN的分級(jí)相關(guān)；P16陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征與HPVl6的整合密切相關(guān)，提示P16是對(duì)CIN分級(jí)和宮頸鱗癌前驅(qū)病變生物學(xué)評(píng)價(jià)的有效標(biāo)志物