1、第一章microRNA-210在腎臟透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與臨床病理分期、分級(jí)的相關(guān)性研究目的:探討microRNA-210(miR-210)在腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)中的表達(dá)及其意義。
　　方法:用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測15例ccRCC及癌旁非腫瘤組織中miR-210的表達(dá)情況,研究其與ccRCC病理分期、分級(jí)之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn),15

2、例ccRCC患者與配對的癌旁非腫瘤組織相比,miR-210在腫瘤組織中的表達(dá)100％上調(diào),其中miR-210在ccRCC中的相對表達(dá)量為7.16±0.63,在癌旁非腫瘤組織中相對表達(dá)量2.27±0.54,兩者表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)15例ccRCC標(biāo)本中,根據(jù)病理分期分級(jí)進(jìn)行分組,Ⅰ期腎癌中miR-210的相對表達(dá)量為7.24±0.66,Ⅰ-Ⅲ期腎癌中為7.60±0.64,兩者相比沒有顯著差異(P＞0.05)。高分化組腎癌中

3、miR-210的相對表達(dá)量為7.06±0.69,中-低分化組腎癌中為7.21±0.63,兩者相比沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1、ccRCC (?)中miR-210的表達(dá)水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調(diào),暗示miR-210可能參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展,miR-210表達(dá)水平的檢測有助于腎癌早期診斷。2、ccRCC中miR-210的表達(dá)水平與病理分期分級(jí)無關(guān)。
　　目的:miR-210對缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)胞細(xì)胞增殖、侵襲

4、能力和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)性狀的影響。
　　方法:實(shí)時(shí)定量PCR檢測常氧、缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)胞株(ACHN)中及正常腎小管上皮細(xì)胞株(HK2)中miR-210的表達(dá)。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染hsa-mir-210inhibitor于缺氧48h的腎癌細(xì)胞株ACHN中,敲低miR-210的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-210表達(dá),MTT法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和Annexin V/PI雙染法分別觀察細(xì)胞增

5、殖、侵襲能力及細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果:常氧狀態(tài)下正常腎小管上皮細(xì)胞株HK2和腎癌細(xì)胞株ACHN細(xì)胞中miR-210的相對表達(dá)量分別為1.47和3.43。缺氧狀態(tài)12h、24h和48h腎癌細(xì)胞株ACHN細(xì)胞中miR-210的相對表達(dá)量分別為4.59、5.30和7.20。腎癌細(xì)胞ACHN常氧組,缺氧組,缺氧抑制組3組比較實(shí)驗(yàn),缺氧抑制組轉(zhuǎn)染sa-mir-210inhibitor,缺氧條件下培養(yǎng)48h后,結(jié)果顯示與缺氧組相比,缺氧抑制組中miR

6、-210的相對表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。用MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制率,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測其侵襲能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hsa-mir-210inhibitot12h、24h、48h后,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組相比,缺氧組細(xì)胞相對存活率顯著升高(P＜0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組細(xì)胞相對存活率顯著降低(P＜0.05)。
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組相比,缺氧組侵

7、襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組相比,缺氧組凋亡率顯著降低(P＜0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和常氧組及缺氧組相比,缺氧抑制組凋亡率顯著增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1、缺氧誘導(dǎo)miR-210在腎癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。2、hsa-mir-210inhibitor能有效的轉(zhuǎn)染于腎癌細(xì)胞中,降低腎癌細(xì)胞中miR

8、-210的表達(dá)。3、缺氧增強(qiáng)腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并且減少細(xì)胞凋亡。4、敲低miR-210表達(dá)抑制了缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)胞ACHN的增殖和侵襲能力,并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目的:探討miR-210調(diào)控缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)胞ACHN的分子學(xué)機(jī)制
　　方法:通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-210的靶基因,通過實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot分別檢測常氧組、缺氧組和缺氧抑制組中的miR-210的表達(dá)量及靶基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:選擇T

9、argetScan、PicTar、mirbase和miRanda這4個(gè)軟件對miR-210進(jìn)行靶基因預(yù)測,VMP1、HOXA9、CBX7、FGFRL1和VAV3均為其可能的靶基因。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測轉(zhuǎn)染48h后常氧組,缺氧組和缺氧抑制組中miR-210的相對含量,結(jié)果顯示和腎癌細(xì)胞缺氧組相比,miR-210的相對含量在缺氧抑制組顯著下調(diào)。靶基因?qū)崟r(shí)定量PCR結(jié)果顯示VMP1的相對表達(dá)量在常氧組、缺氧組和缺氧抑制組ACHN細(xì)胞中

10、分別為3.3408±0.4391,1.3457±0.5235和2.2383±0.1785,三組相比有顯著性差異(P＜0.05);FGFRL1的相對表達(dá)量在三個(gè)組中分別為1.5235±0.7928,1.0996±0.3853和2.6076±0.4544;與缺氧組相比,缺氧抑制組中FGFRL1的相對表達(dá)量顯著性上調(diào)(P＜0.05);HOXA9、CBX7和VAV3在三個(gè)組中表達(dá)無顯著性差異。Western blot結(jié)果顯示HOXA9的蛋白表達(dá)

11、比值(HOXA9/GAPDH)在3個(gè)組分別為0.283±0.016,0.535±0.021和0.509±0.024,缺氧組與常氧組相比HOXA9的蛋白表達(dá)比值顯著性上調(diào)(P＜0.05),而缺氧組與缺氧抑制組相比無顯著性差異(P＞0.05);FGFRL1的蛋白表達(dá)比值(FGFRL1/GAPDH)在三個(gè)組中分別為0.208±0.01,0.151±0.01和0.471±0.11,缺氧組與常氧組相比FGFRL1的蛋白表達(dá)比值顯著性下調(diào)(P＜0.

12、05),缺氧抑制組與缺氧組相比FGFRL1的蛋白表達(dá)比值顯著性上調(diào)(P＜0.05)。VMP1、CBX7和VAV3在三個(gè)組中表達(dá)無顯著性差異。
　　結(jié)論:1、缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)胞中FGFRL1基因和蛋白表達(dá)與miR-210的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性;VMP1基因表達(dá)與miR-210的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)而蛋白表達(dá)量與miR-210的表達(dá)無關(guān);HOXA9、CBX7、和VAV3基因、蛋白表達(dá)與之無明顯關(guān)系。2、FGFRL1為miR-210在缺氧狀態(tài)下腎癌細(xì)