1、海灣扇貝和櫛孔扇貝作為我國(guó)優(yōu)良的海水養(yǎng)殖品種近年來(lái)得到了很大的推廣，構(gòu)成了海洋貝類養(yǎng)殖業(yè)的主體。盡管我國(guó)的扇貝養(yǎng)殖規(guī)模在過(guò)去的幾十年中達(dá)到一定水平，養(yǎng)殖總產(chǎn)量也居國(guó)際領(lǐng)先地位，但貝類的分子免疫學(xué)及其相關(guān)的病害防治研究相對(duì)國(guó)外卻相對(duì)薄弱，近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)殖扇貝的病害問(wèn)題一直困擾著該產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。盡管針對(duì)扇貝養(yǎng)殖環(huán)境、病原以及養(yǎng)殖技術(shù)等方面開(kāi)展了大量的研究工作，提出了許多防病治病措施，也取得了一定的成效。但由于引起養(yǎng)殖扇貝病害的病原和

2、發(fā)病原因的多樣性，大量使用抗菌素和農(nóng)藥后造成病原微生物抗藥性的提高以及對(duì)環(huán)境造成的嚴(yán)重破壞，所以貝類養(yǎng)殖業(yè)要擺脫病害的困擾，必須開(kāi)辟新的疾病防治途徑。本研究從2個(gè)方面開(kāi)展扇貝分子免疫學(xué)的工作，一是篩選和克隆了參與調(diào)控免疫防御的功能基因，根據(jù)抗病功能基因的結(jié)構(gòu)以及這些基因在個(gè)體或群體感染后或環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)情況，深入研究扇貝的防御抗病機(jī)制，探討提高機(jī)體抗病力的方法和途徑，并作為抗病良種選育的分子標(biāo)記，指導(dǎo)扇貝的遺傳改良和抗病品系的培育

3、。二是篩選研制新型的具有抗微生物活性的多肽或蛋白基因，并對(duì)這些基因?qū)崿F(xiàn)體外大量表達(dá)，在扇貝養(yǎng)殖業(yè)上作為新型的病害預(yù)防治療制劑，取代目前普遍使用的抗菌素和化學(xué)藥物。 1.櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白cDNA的克隆與免疫相關(guān)性研究含硒的生物大分子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本研究采取大規(guī)模的EST(ExpressedSequenceTag)測(cè)序方法，結(jié)合錨定PCR技術(shù)克隆得到了1個(gè)櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列。櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白zS

4、eBP全長(zhǎng)1664bp，包括一個(gè)33bp的5'末端非編碼(untranslatedregion，UTR)和一個(gè)188bp的3'UTR，其開(kāi)放式讀碼框(openreadingframe，ORF)長(zhǎng)1443bp，可編碼480個(gè)氨基酸組成的zSeBP前體蛋白，預(yù)測(cè)分子量為54kDa，等電點(diǎn)為6.5。同源性分析表明克隆的zSeBPcDNA序列與哺乳動(dòng)物、魚(yú)類、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)甚至微生物和植物的硒結(jié)合蛋白基因都具有很高的相似性。這表明從櫛孔扇貝中克隆得

5、到的cDNA序列是硒結(jié)合蛋白家族的成員比且硒結(jié)合蛋白在生物體內(nèi)具有重要的不可替代的作用。為了驗(yàn)證zSeBP的免疫相關(guān)性，我們用比較免疫學(xué)的方法分別用雙氧水和三種不同類型的微生物來(lái)刺激櫛孔扇貝并用半定量RT-PCR檢測(cè)zSeBP刺激后不同時(shí)間段在血淋巴中mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)我們?nèi)∠鄳?yīng)的全組織勻漿液檢測(cè)丙二醛(MDA)的指標(biāo)。結(jié)果表明，雙氧水或微生物刺激后zSeBP在血淋巴的mRNA表達(dá)水平可顯著加強(qiáng)并且它們的表達(dá)趨勢(shì)相近，這說(shuō)明它們的

6、應(yīng)激機(jī)理相似，都是由于在刺激過(guò)程中氧代謝的失衡引發(fā)zSeBP的表達(dá)；同時(shí)MDA的指標(biāo)升高也說(shuō)明在微生物刺激后扇貝體內(nèi)的氧代謝平衡被打破，比較不同微生物刺激后的zSeBP的表達(dá)水平和MDA的指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)它們存在負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明zSeBP在扇貝防御微生物感染和維持體內(nèi)正常氧代謝的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。 2.櫛孔扇貝和海灣扇貝G型溶菌酶基因cDNA的克隆與分析溶菌酶是自然界中廣泛存在的具有抗菌效應(yīng)的分子，它在無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫反應(yīng)中發(fā)

7、揮著重要的作用。通過(guò)EST和錨定PCR技術(shù)，從海灣和櫛孔扇貝中克隆得到一種溶菌酶基因的全長(zhǎng)cDNA。海灣扇貝溶菌酶基因的cDNA全長(zhǎng)659bp，櫛孔扇貝溶菌酶基因的cDNA全長(zhǎng)829bp，均編碼200個(gè)氨基酸。BLASTx分析的結(jié)果顯示它們和脊椎動(dòng)物g-型溶菌酶相似性較高，卻不同于無(wú)脊椎動(dòng)物中己發(fā)現(xiàn)的c型和i型溶菌酶。在其編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了g型溶菌酶的活性中心(Glu82，Asp97，Asp108)，同時(shí)6個(gè)保守的半胱氨酸也與鳥(niǎo)類

8、和魚(yú)類的g型溶菌酶相一致。結(jié)合BLAST分析的結(jié)果，可以確認(rèn)所獲得的cDNA序列是一種在無(wú)脊椎動(dòng)物中首次發(fā)現(xiàn)的G型溶菌酶的編碼序列。采用Clustalw軟件，對(duì)多種脊椎動(dòng)物c-型、g-型溶菌酶和無(wú)脊椎動(dòng)物c-型、i-型溶菌酶以及本研究發(fā)現(xiàn)的無(wú)脊椎動(dòng)物g型溶菌酶進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)脊椎動(dòng)物c-型、i-型溶菌酶和脊椎動(dòng)物c-型溶菌酶同源性較高，而海灣扇貝g型溶菌酶和脊椎動(dòng)物g-型溶菌酶同源性較高。由此說(shuō)明c-型、g-型溶菌酶從無(wú)脊椎到脊椎動(dòng)