1、對動物性別決定和性腺發(fā)育相關(guān)基因的研究是發(fā)育生物學重要的研究內(nèi)容之一,也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中性別人工控制的理論基礎。Dmrt基因最早是在果蠅和線蟲中發(fā)現(xiàn),隨后在從無脊椎動物到哺乳動物的多種物種中均可獲得dmrt基因,該家族蛋白享有共同的DM保守結(jié)構(gòu)域,并在一定程度上顯示了功能的保守性。在脊椎動物中它們參與了諸如性別決定、性腺分化和發(fā)育以及個體發(fā)育、組織功能維持等生物學過程。
　　 本文采用同源克隆技術(shù),從櫛孔扇貝精巢中克隆了dmrt基

2、因家族中的Cf-dmrt4-like基因的全長cDNA及其2個拼接片段Cf-dmrt4a-like和Cf-dmrt4b-like,分析了它們的序列特征;利用半定量RT-PCR、相對定量qRT-PCR技術(shù)、整體和組織原位雜交方法,分析了該基因在櫛孔扇貝胚胎發(fā)育、性腺發(fā)育和各組織中的時空表達特征和規(guī)律;進一步采用RNAi技術(shù),通過體外注射Cf-dmrt4-like dsRNA到櫛孔扇貝生長期性腺中,定量PCR檢測了目的基因在體內(nèi)的表達。

3、r>　　 櫛孔扇貝Cf-dmrt4-like基因的cDNA全長為2312 bp,ORF 1110 bp,編碼369個氨基酸;其氨基酸序列具有DMRT蛋白特有的DM保守結(jié)構(gòu)域,且在C端擁有DMRT4和DMRT5蛋白共有的DMA保守結(jié)構(gòu)域,以及DMRT4和DMRT5蛋白特有的短保守序列(short motif 1)。序列比對和系統(tǒng)進化分析顯示,Cf-DMRT4-LIKE蛋白與其它物種的DMRT4蛋白的相似性最高,且首先與DMRT4蛋白聚類

4、,這一結(jié)果也說明了Cf-dmrt4-like基因在進化上的保守性。本實驗還克隆獲得了Cf-dmrt4a-like基因cDNA片段,長1638bp,編碼143個氨基酸以及Cf-dmrt4b-like基因cDNA片段,長1641bp,編碼104個氨基酸,初步分析其為Cf-dmrt4-like基因的拼接產(chǎn)物。
　　 半定量RT-PCR,Cf-dmrt4-like mRNA在雌性成體組織的鰓、外套膜、腎、閉殼肌、性腺及雄性鰓和性腺中表達

5、。熒光定量qRT-PCR分析結(jié)果顯示,該基因在各發(fā)育期的雌雄兩性性腺中均有表達,且成熟期精巢中的表達量與其余各期精巢中的表達量呈顯著性差異,約是其它時期的20倍;然而各期卵巢以及增殖期與生長期精巢中的表達量未顯示顯著性差異,表明該基因參與了櫛孔扇貝兩性性腺的發(fā)育,尤其在成熟期精巢的發(fā)育中起重要的作用。原位雜交結(jié)果顯示,Cf-dmrt4-like mRNA分布在各期卵巢的卵原細胞、卵母細胞的胞質(zhì)和核中,其中成熟期卵巢各期生卵細胞中的陽性信

6、號略強于增殖期和生長期;Cf-dmrt4-like mRNA也定位于各期精巢的精原、精母和精細胞中,成熟期各期生精細胞中的陽性信號更加明顯;在性腺的體細胞中未見目的基因的表達。上述結(jié)果暗示Cf-dmrt4-like基因參與了生殖細胞的分化和功能維持。
　　 胚胎和幼蟲的半定量RT-PCR和熒光定量qRT-PCR結(jié)果證實,Cf-dmrt4-like基因在未受精卵、受精卵、卵裂期胚胎、各期幼蟲中均有表達。未受精卵Cf-dmrt4-l

7、ike基因的表達量顯著高于各期胚胎的表達量,D形幼蟲的表達量顯著高于殼頂幼蟲和附著前幼蟲的表達量(p＜0.05)。原位雜交結(jié)果顯示,Cf-dmrt4-like基因的藍色陽性信號主要集中在未受精卵和早期胚胎的中間部位,隨著發(fā)育的進行,信號相繼集中在幼蟲的外套膜和鰓處,暗示該基因參與櫛孔扇貝鰓和外套膜組織的早期構(gòu)建,進一步因其在成體的鰓和外套膜組織中也有表達,推測其在櫛孔扇貝鰓和外套膜等組織的構(gòu)建和功能維持中發(fā)揮一定的作用。Cf-dmrt4