1、磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1（Phosphotyrosine interaction domain containing1，PID1）是一個(gè)近期發(fā)現(xiàn)的在肥胖者腹膜后脂肪組織中高表達(dá)的基因，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因參與胰島素抵抗，并且可能與脂質(zhì)代謝有關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同肌內(nèi)脂肪含量的豬PID1表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪的沉積呈顯著正相關(guān)。因此，PID1可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。本研究以豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為研究對象，探討PID1基因?qū)ωi肌內(nèi)前體脂肪細(xì)

2、胞增殖和分化的影響，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.豬PID1基因原核表達(dá)、純化、多克隆抗體制備及組織表達(dá)譜分析
　　以pET28a(+)為載體，大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌表達(dá)豬PID1基因CDS區(qū)和組氨酸標(biāo)簽融合的重組蛋白。SDS-PAGE顯示表達(dá)出的蛋白分子量約32 kDa，經(jīng)過表達(dá)條件的優(yōu)化，重組蛋白能夠在30℃、經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h得到高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到宿主菌總蛋白的60％。溶解性分析

3、表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體使用6 mol/L鹽酸胍溶解后，使用親和層析法進(jìn)行純化，最終重組蛋白濃度達(dá)到了1.6 mg/mL，并且SDS-PAGE檢測可見單一條帶。對純化后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明純化的重組蛋白為豬PID1蛋白。重組蛋白經(jīng)稀釋法復(fù)性后處理增殖中的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該蛋白能促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖，表明復(fù)性后的蛋白具有生物學(xué)活性。
　　另外，本研究用純化后的蛋白多次免疫SD大鼠的方

4、法制備多克隆抗體。多克隆抗體的效價(jià)和特異性分別用間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)和Western Blot鑒定。ELISA結(jié)果表明，制備的多克隆抗體滴度達(dá)1∶20480; Western Blot結(jié)果顯示該多克隆抗體能夠特異性識別PID1蛋白，表明多克隆抗體制備成功，這將為研究PID1的功能提供一個(gè)很好的工具。
　　以10周齡DLY豬為研究對象，使用自制的多克隆抗體檢測了PID1基因在腰大肌、趾長伸肌、脂肪、背最長肌、腎、肺、脾、肝臟和心臟中的表

5、達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PID1蛋白主要表達(dá)于肌肉組織，其次是肝臟。這表明PID1可能影響脂質(zhì)代謝，尤其可能影響肌肉組織中脂質(zhì)代謝。因此，PID1可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。
　　2.PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響
　　哺乳動物肌內(nèi)脂肪的80％以上存儲于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，因此本試驗(yàn)探討了PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。首先，采用差數(shù)貼壁法從3日齡DLY豬背最長肌中分離肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，免疫熒光檢測前脂肪細(xì)

6、胞特異性基因Pref-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎100％細(xì)胞表達(dá)Pref-1;同時(shí)油紅O染色結(jié)果顯示本試驗(yàn)分離的細(xì)胞能夠分化為成熟脂肪細(xì)胞。其次，采用添加豬PID1重組蛋白和轉(zhuǎn)染PID1過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-pPID1兩種方法，探討PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組豬PID1蛋白處理以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-pPID1均能促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖。最后，為了研究PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響，

7、處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.5μg pcDNA3.1(+)-pPID1，對照組轉(zhuǎn)染等量的pcDNA3.1(+)，誘導(dǎo)分化8 d之后檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明PID1過表達(dá)顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞分化主要轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、PPARγ的mRNA水平和蛋白水平，并且顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞分化早期標(biāo)志基因LPL的mRNA水平，這表明PID1能促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪的分化。
　　綜上所述，本研究首次用原核表達(dá)系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復(fù)性的方法制備了