1、背景與目的：心肌慢性缺氧是臨床常見(jiàn)的病理生理過(guò)程,可導(dǎo)致心肌產(chǎn)生一系列代謝適應(yīng)性改變,與線粒體的數(shù)量和功能密切相關(guān)的線粒體生物合成過(guò)程的適應(yīng)性改變可能是其中重要的環(huán)節(jié),但慢性缺氧對(duì)心肌線粒體生物合成影響的機(jī)制目前尚不完全清楚。一氧化氮(NO)可能參與了多種細(xì)胞線粒體生物合成的調(diào)控,其在慢性缺氧心肌線粒體生物合成中的作用尚不明了。深入研究NO與慢性缺氧心肌線粒體的適應(yīng)性改變和調(diào)控之間的關(guān)系,將有望闡明缺氧狀態(tài)下心肌的病理生理改變機(jī)制,為進(jìn)

2、一步增強(qiáng)缺氧狀態(tài)下的心肌保護(hù),提高臨床治療效果提供新的思路。本課題分別在先天性心臟病心肌組織標(biāo)本和體外培養(yǎng)慢性缺氧心肌細(xì)胞模型上,對(duì)心肌細(xì)胞的線粒體生物合成和NO信號(hào)通路變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究,探討NO在慢性缺氧狀態(tài)下對(duì)心肌線粒體生物合成的調(diào)控作用機(jī)制。 研究方法：本研究共分為三部分: 第一部分:選取紫紺型和非紫紺型先天性心臟病患者各10例,留取手術(shù)中切除的肥厚右室流出道組織,通過(guò)電鏡觀察分析標(biāo)本心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),運(yùn)用實(shí)

3、時(shí)熒光PCR、RT-PCR及Western blot等方法比較心肌組織mtDNA拷貝數(shù),細(xì)胞色素c氧化酶I (COX I)、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Tfam)和三型NOS的mRNA或(和)蛋白水平,檢測(cè)NOS酶活性,并對(duì)PGC-1α、eNOS蛋白水平與患者末梢血氧飽和度SaO2進(jìn)行相關(guān)性分析。第二部分:體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,根據(jù)不同干預(yù)因素將心肌細(xì)胞分為對(duì)

4、照組,NO供體SNAP組,SNAP+NO清除劑氧合血紅蛋白(OxyHb)組及SNAP+可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)抑制劑(ODQ)組。應(yīng)用線粒體熒光探針在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞線粒體量的變化,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR、RT- PCR及Western blot等方法分別比較各組細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平以及COXI蛋白水平等。第三部分:通過(guò)1％O2濃度培養(yǎng)48小時(shí)建立體外培養(yǎng)乳鼠心肌

5、細(xì)胞慢性缺氧模型,根據(jù)不同干預(yù)方式將心肌細(xì)胞分為對(duì)照組,慢性缺氧組,慢性缺氧+NOS抑制劑L-NAME組,慢性缺氧+OxyHb組以及慢性缺氧+ODQ組。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO濃度和心肌細(xì)胞NOS蛋白水平,應(yīng)用線粒體熒光探針觀察各組細(xì)胞線粒體量的變化,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR、RT- PCR及Western blot等方法分別比較各組細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平以及COX I蛋白水平等。

6、 研究結(jié)果：本研究主要結(jié)果如下: 1.紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中線粒體體密度Vv、數(shù)密度Nv明顯高于非紫紺組(p0.05, p0.01),mtDNA拷貝數(shù)顯著高于非紫紺組(p0.01),COX I、PGC-1α、NRF1和Tfam的mRNA水平均顯著高于非紫紺組(p0.01),COX I、eNOS蛋白表達(dá)顯著高于非紫紺組(p0.05, p0.05),心肌組織PGC-1αmRNA水平與SaO2呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.75,

7、 p0.01),eNOS蛋白水平與SaO2呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.64, p0.01),PGC-1αmRNA水平與eNOS蛋白水平呈顯著的正相關(guān)(r=0.58, p0.01); 2. (1) NO供體SNAP干預(yù)組心肌細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA和蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(p0.01, p0.01, p0.01, p0.01),與線粒體生物合成相關(guān)的信號(hào)分子PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA水平也高

8、于對(duì)照組(p0.01, p0.01, p0.05); (2)與SNAP組比較,SNAP+OxyHb組線粒體熒光強(qiáng)度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA均降低(p0.01, p0.01, p0.05),PGC-1α和NRF1 mRNA水平也降低(p0.01, p0.05); (3)與SNAP組比較,SNAP+ODQ組線粒體熒光強(qiáng)度、mtDNA拷貝數(shù)和COXI mRNA水平均降低(p0.05, p0.01, p0.05),PGC-1αmR

9、NA水平也降低(p0.05); 3. (1)慢性缺氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO濃度明顯高于對(duì)照組(p0.01),iNOS和eNOS蛋白水平明顯高于對(duì)照組(p0.05, p0.05);慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA水平均明顯高于對(duì)照組(p0.01, p0.01, p0.01),與線粒體生物合成相關(guān)的信號(hào)分子PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA水平也高于對(duì)照組(p0.01, p0.05, p0.01)

10、; (2)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ L-NAME組線粒體熒光強(qiáng)度、COXI mRNA和蛋白水平均降低(p0.01, p0.01, p0.05),PGC-1α和Tfam mRNA水平也降低(p0.05,p0.01); (3)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ OxyHb組PGC-1αmRNA水平降低(p0.05),其它指標(biāo)無(wú)明顯變化; (4)與慢性缺氧組比較,慢性缺氧+ODQ組線粒體熒光強(qiáng)度、mtDNA拷貝數(shù)、COXI mRNA和蛋白水平均

11、降低(p0.01, p0.05, p0.01, p0.05),PGC-1α和Tfam mRNA水平也降低(p0.01, p0.05)。 結(jié)論：本課題分別在先天性心臟病心肌組織標(biāo)本和體外培養(yǎng)慢性缺氧心肌細(xì)胞模型上,對(duì)心肌細(xì)胞的線粒體生物合成和NO信號(hào)通路變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究,探討NO在慢性缺氧狀態(tài)下對(duì)心肌線粒體生物合成的調(diào)控作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 1.紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中線粒體數(shù)量增多, mtDNA拷貝數(shù)

12、增多,線粒體編碼的COXI蛋白mRNA和蛋白水平升高。說(shuō)明紫紺型先天性心臟病心肌線粒體生物合成明顯增多;同時(shí),紫紺型先天性心臟病右室流出道心肌組織中eNOS蛋白水平升高,并且與線粒體生物合成呈顯著的正相關(guān),提示其參與了線粒體生物合成的調(diào)節(jié); 2. NO供體在體外可以促進(jìn)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的線粒體生物合成,該過(guò)程可能通過(guò)sGC-cGMP途徑介導(dǎo); 3.慢性缺氧的培養(yǎng)心肌細(xì)胞中iNOS和eNOS蛋白表達(dá)升高,NO合成增多,同時(shí)線粒體的生物合成上調(diào)