1、肺動(dòng)脈高壓是嚴(yán)重危害人類身心健康的一種疾病,其發(fā)病僅次于高血壓和冠心病,在心血管疾病中位居第三位。其特征是肺血管收縮和肺血管改建,并最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡。引起肺動(dòng)脈高壓的原因很多,隨著社會(huì)的發(fā)展,以缺氧和呼吸系統(tǒng)疾病所致的肺動(dòng)脈高壓發(fā)病率正逐年上升。缺氧引起的肺血管收縮是肺動(dòng)脈高壓和肺心病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。肺血管收縮與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度密切相關(guān)。Vadula等發(fā)現(xiàn),缺氧可引起肝細(xì)胞內(nèi)線粒體源性活性氧產(chǎn)生增加1,從而使線粒體在HPV中的

2、作用受到特別關(guān)注。大量研究已基本證實(shí),HPV的核心機(jī)制主要是缺氧誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生活性氧,從而抑制肺血管平滑肌細(xì)胞膜上的電壓門控性K+通道,使細(xì)胞膜去極化,細(xì)胞外鈣內(nèi)流,最終導(dǎo)致細(xì)胞收縮2。與缺氧性肺血管收縮反應(yīng)不同的是,體循環(huán)血管在缺氧時(shí)表現(xiàn)為舒張,以此增加血流量,保證組織的供血和供氧。有研究表明,缺氧使得肺循環(huán)血管K+通道受抑制,血管收縮,而體循環(huán)血管K+電流增加,血管擴(kuò)張3。在缺氧刺激下,肺動(dòng)脈平滑肌能量產(chǎn)生和利用增加,股動(dòng)脈平滑肌則

3、迅速降低,從而使得肺動(dòng)脈收縮而股動(dòng)脈舒張,由此可見,肺、體循環(huán)動(dòng)脈血管平滑肌在缺氧時(shí)的變化差異可能與能量有關(guān)。
　　線粒體是細(xì)胞能量生成和氧化磷酸化的主要場(chǎng)所,不同的組織因?yàn)槟芰啃枨蟛煌渚€粒體也存在差異。其差異不僅僅表現(xiàn)在線粒體數(shù)目上4,而且也體現(xiàn)在形態(tài)5、結(jié)構(gòu)6,7和功能8等諸多方面,即線粒體存在異質(zhì)性。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的線粒體和體循環(huán)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的線粒體,無論是在功能還是形態(tài)上,都有差異,肺動(dòng)脈平滑肌中的線粒體多呈現(xiàn)梭

4、形或者橢圓形,基礎(chǔ)呼吸率較高,而股動(dòng)脈平滑肌中的線粒體則多為長條形,基礎(chǔ)呼吸率較肺動(dòng)脈平滑肌低9。線粒體源性的活性氧在HPV中發(fā)揮關(guān)鍵作用,促使人們?cè)絹碓街匾暰€粒體異質(zhì)性在肺、體循環(huán)血管對(duì)缺氧反應(yīng)差異中所起的作用,然而,要深入揭示其中的機(jī)制和意義有待新的技術(shù)路線和研究策略。
　　通過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),離體分離的線粒體在相當(dāng)程度上能夠保持其在體內(nèi)或者細(xì)胞內(nèi)的功能和特征,而且能夠融入到培養(yǎng)的細(xì)胞、離體血管以及活體肺循環(huán)血管平滑肌細(xì)胞中,

5、在此基礎(chǔ)之上,本研究將深入探討線粒體差異對(duì)缺氧性肺血管收縮和肺動(dòng)脈高壓的影響,以期望為肺動(dòng)脈高壓機(jī)制研究和治療提供可供探索的全新的途徑。
　　第一部分：線粒體異質(zhì)性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞急性缺氧反應(yīng)的影響
　　目的：
　　探討外源性線粒體向細(xì)胞內(nèi)移植的動(dòng)力學(xué)特征,并在此基礎(chǔ)上觀察,分別移植同源性和異源性線粒體對(duì)PASMC和FASMC缺氧反應(yīng)的影響。
　　方法：
　　用DsRed-mito和GFP-mito標(biāo)記平滑

6、肌細(xì)胞線粒體;利用梯度離心法從細(xì)胞中提取帶熒光標(biāo)記的線粒體并孵育細(xì)胞;用共聚焦熒光顯微鏡觀察外源性線粒體在細(xì)胞被的分布情況,并分析外源性線粒體移植的動(dòng)力學(xué)特征;用EB抑制內(nèi)源性線粒體DNA合成;用Fura-2/AM探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化;用JC-1檢測(cè)細(xì)胞膜電位。
　　結(jié)果：
　　1.活細(xì)胞共聚焦成像技術(shù)觀察,空白對(duì)照組PASMC沒有任何熒光顯示,而孵育了標(biāo)記DsRed外源性線粒體的PASMC組,細(xì)胞內(nèi)有紅色熒光,表明外源

7、性線粒體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。通過二維熒光計(jì)數(shù)分析可知,外源性線粒體進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量具有孵育濃度和時(shí)間依賴性。而通過共聚焦三維重構(gòu)發(fā)現(xiàn),進(jìn)入細(xì)胞的外源性主要分布在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域內(nèi)。
　　2.對(duì)照組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧時(shí),胞漿內(nèi)鈣離子濃度增加,與添加Py+Ur(提供細(xì)胞所需的能量)的細(xì)胞反應(yīng)一致;而添加Py+Ur+EB(EB耗竭細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA合成,同時(shí)Py和Ur為細(xì)胞提供能量)的細(xì)胞缺氧時(shí),胞漿內(nèi)鈣離子濃度沒有變化;移植入PASMC-mi

8、to可逆轉(zhuǎn)線粒體DNA剔除的PASMC胞漿內(nèi)鈣反應(yīng)消失;而移植入FASMC-mito卻無此作用。
　　缺氧誘導(dǎo)FASMC胞漿內(nèi)鈣離子濃度降低,添加Py+Ur不影響股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧時(shí)鈣離子降低;線粒體DNA剔除則使細(xì)胞在缺氧時(shí)不引起細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度降低,移植PASMC-mito后使線粒體DNA剔除的細(xì)胞在缺氧時(shí)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高;而移植FASMC-mito可恢復(fù)缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降這一反應(yīng)。PASMC和

9、FASMC在不剔除自身內(nèi)源性線粒體的條件下直接轉(zhuǎn)入外源性線粒體,其對(duì)缺氧引起的鈣反應(yīng)的影響類似于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　3.移植了PASMC-mito的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在缺氧時(shí),細(xì)胞膜去極化,反應(yīng)與正常肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞一樣,然而移植了FASMC-mito后細(xì)胞膜出現(xiàn)超極化。移植同源性細(xì)胞線粒體的FASMC在缺氧時(shí),和正常股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞一樣,細(xì)胞膜均超極化;而移植來自異種細(xì)胞線粒體(PASMC-mito)后,缺氧會(huì)引起細(xì)胞膜穩(wěn)定去極化

10、。
　　結(jié)論：
　　1.外源性線粒體移植入細(xì)胞的數(shù)量具有時(shí)間和濃度依賴性,并且空間分布主要位于靠近細(xì)胞膜一側(cè)。
　　2.移植FASMC-mito可以使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在缺氧時(shí)降低,而移植PASMC-mito可使股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在缺氧時(shí)升高。
　　3.移植FASMC-mito可以使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位在缺氧時(shí)降低,而移植PASMC-mito則使股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位在缺氧時(shí)升高。
　

11、　第二部分：線粒體異質(zhì)性對(duì)缺氧性肺血管收縮和肺動(dòng)脈高壓的影響
　　目的：
　　探討外源性同源、異源線粒體移植對(duì)離體血管環(huán)急性缺氧反應(yīng)以及載體肺動(dòng)脈高壓的影響
　　方法：
　　梯度離心法分離細(xì)胞內(nèi)線粒體,并孵育離體血管環(huán),通過張力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管環(huán)收縮功能;通過尾靜脈注射的方式將外源性線粒體移植到大鼠體內(nèi);用常壓低氧法建立大鼠慢性缺氧模型,并利用四導(dǎo)儀分別檢測(cè)模型大鼠的肺動(dòng)脈壓和體循環(huán)壓;通過組織石蠟切塊HE染色觀察肺

12、血管重構(gòu)和肌化程度。
　　結(jié)果：
　　1.去除內(nèi)皮的PA缺氧時(shí)收縮;移植PASMC-mito的PA缺氧時(shí)收縮程度比對(duì)照組略有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;移植FASMC-mito的PA,在缺氧時(shí)并無收縮反應(yīng)。
　　內(nèi)皮完整的PA缺氧1小時(shí),PA呈現(xiàn)經(jīng)典的兩相收縮反應(yīng);移植PASMC-mito后,對(duì)缺氧反應(yīng)無明顯影響;移植FASMC-mito的PA,缺氧時(shí)的兩相收縮反應(yīng)均有不同程度的抑制。
　　2.去除內(nèi)皮的FA缺氧時(shí)舒張

13、;移植FASMC-mito對(duì)FA缺氧引起的舒張無顯著影響;但是移植PASMC-mito后,FA對(duì)缺氧產(chǎn)生收縮反應(yīng)。
　　內(nèi)皮完整的FA缺氧1小時(shí),FA持續(xù)舒張,直至到達(dá)基線張力水平;移植FASMC-mito后,缺氧時(shí)FA的反應(yīng)與對(duì)照組一致;但是移植PASMC-mito后,缺氧引起FA呈現(xiàn)經(jīng)典兩相收縮反應(yīng)。
　　3.空白對(duì)照組大鼠缺氧10分鐘,肺動(dòng)脈壓和體循環(huán)壓分別出現(xiàn)典型的升高和降低;尾靜脈注射PASMC-mito的實(shí)驗(yàn)組大

14、鼠,與對(duì)照組相比,其缺氧時(shí)肺動(dòng)脈壓略有升高;而尾靜脈注射FASMC-mito可降低缺氧引起的肺動(dòng)脈壓升高。此外,無論是PASMC-mito還是FASMC-mito注射,對(duì)大鼠體循環(huán)壓沒有任何影響。為了排除心輸出量的影響,同時(shí)計(jì)算了血管阻力值,得出的結(jié)論與肺動(dòng)脈壓結(jié)果一致,即移植PASMC-mito,大鼠肺血管阻力略有增加;移植FASMC-mito可顯著降低缺氧引起的大鼠肺血管阻力升高。同樣,外源性線粒體移植對(duì)體循環(huán)阻力沒有任何影響。

15、r>　　4.正常環(huán)境下飼養(yǎng)的對(duì)照組大鼠,無論是尾靜脈注射PBS還是外源性線粒體,其Ppa、PVR和RV/(LV+S)都沒有變化;而慢性缺氧模型組,缺氧模型建立后無論是尾靜脈注射PBS還是外源性線粒體,與各自對(duì)照組相比,Ppa、PVR和RV/(LV+S)均明顯升高;其中,尾靜脈注射FASMC-mito組,相對(duì)于CH+PBS(CH表示慢性缺氧)組和CH+PASMC-mito組,以上三個(gè)指標(biāo)均有所下降。而體循環(huán)動(dòng)脈壓沒有因?yàn)橥庠葱跃€粒體的移植

16、而發(fā)生任何變化;尾靜脈注射了FASMC-mito后,大鼠的肺動(dòng)脈肌化程度也明顯減弱或者消失。在慢性缺氧過程中給予外源性線粒體尾靜脈注射,得出的結(jié)論同上述結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.移植FASMC-mito使PA缺氧時(shí)收縮程度降低,移植PASMC-mito使FA缺氧反應(yīng)由舒張變?yōu)槭湛s。
　　2.靜脈注射FASMC-mito能夠降低缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓,靜脈注射PASMC-mito對(duì)肺動(dòng)脈高壓沒有影響,兩種外源性線粒體