雞IFN-γ基因的克隆與原核表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、  干擾素(Interferon,IFN)是一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用的細胞因子。其中,Ⅱ型干擾素(又稱作IFN-γ)是在抗原或有絲分裂原的刺激下,主要由活化的T淋巴細胞及NK細胞所產(chǎn)生,它影響機體的細胞免疫和體液免疫反應。為了了解雞IFN-γ在抗病毒免疫應答中的作用及其機理,本研究進行了該基因的克隆、表達和鑒定?! ∈紫龋鶕?jù)GenBank已登錄的雞IFN-γ序列,應用PrimerPremier5.0軟件設計了一對引物,應用反轉(zhuǎn)

2、錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術,從經(jīng)刀豆素A(ConA)誘導活化的雞脾淋巴細胞總RNA中擴增得到一條特異性基因片段,其大小約為500bp。PCR產(chǎn)物分離純化后將其克隆到原核表達載體pGEX-4T-1上,經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRI、SalI雙酶切鑒定,篩選出陽性重組克隆后進行序列測定?! ∑浯?,對該序列及多種動物的IFN-γ運用計算機序列分析軟件進行核苷酸和氨基酸序列的比較分析和遺傳進化分析?;蜻M化樹和氨基酸進化樹分析表明:本研

3、究所克隆的ChIFN-γ序列,無論從核苷酸水平還是氨基酸水平,與雞形目和哺乳類動物的IFN-γ序列的進化關系均比雞Ⅰ型干擾素近,同時經(jīng)抗原性比較分析,雞形目下IFN-γ的抗原性有較高的相似性。  最后,將重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-IFN-γ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌,經(jīng)37℃和1.0mmol/LIPTG的誘導表達,SDS-PAGE凝膠電泳表明該基因在大腸桿菌中得到高效表達,且表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。融合蛋白的分子量約為43k

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