1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種重要傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。目前，PRRS在全球范圍內(nèi)流行，2006年，我國南方地區(qū)爆發(fā)高致病性PRRS(HP-PRRS)，給養(yǎng)豬帶來巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV變異范圍廣，病毒感染后造成免疫功能的損害，保護性免疫應(yīng)答水平低，病毒持續(xù)感染

2、時間長，其分子機理仍然不清楚。PRRSV感染性克隆是研究病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的重要工具，建立國內(nèi)流行毒株的反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺將為研究病毒的感染機理和免疫機理奠定基礎(chǔ)。
　　根據(jù)已測定的PRRSV/GSWW/15分離株的全長基因組序列信息，采用合成生物學(xué)的方法，將全長基因組序列分為兩段（7636bp和7774bp）分別插入低拷貝pBR322載體中，然后將兩個半長片段相連接得到全長cDNA克隆。將質(zhì)粒線化后，體外轉(zhuǎn)錄獲得全長RNA，經(jīng)

3、電穿孔轉(zhuǎn)染BHK-21細胞拯救獲得了初代病毒。初代病毒接種Marc-145細胞進行傳代，接毒后36 h即可觀察到完全的致病變效應(yīng)(CPE)。通過RT-PCR、間接免疫熒光、測序驗證，證明成功獲得了PRRSV/GSWW/15株的感染性克隆。通過實時熒光定量法檢測拯救病毒復(fù)制能力與原田間分離毒沒有顯著差異，拯救病毒感染后48 h達復(fù)制的最高水平，最高滴度達1×1010 copies/mL。本研究表明，采用長片段基因合成的方法進行PRRSV感

4、染性克隆的構(gòu)建，方法可行且速度快，為PRRSV流行毒感染致病機理、免疫機制和基于反向遺傳學(xué)的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。
　　由于多個弱毒疫苗毒株的大量應(yīng)用，導(dǎo)致疫苗毒與流行毒的重組事件頻繁發(fā)生，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，成為當(dāng)前我國PRRS防控中存在的主要問題。研制能區(qū)分疫苗免疫和自然野毒感染的標記疫苗已成為當(dāng)前PRRS防控的重要技術(shù)需求。研究表明，NSP2是PRRSV變異程度最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，中間高變區(qū)存在不連續(xù)的缺失，而且

5、存在多個具有免疫優(yōu)勢的B細胞表位，是研制表位缺失標記疫苗的候選區(qū)域，因此，本研究在PRRSV/GSWW/15株感染性克隆的基礎(chǔ)上，采用融合PCR方法構(gòu)建一系列NSP2中間高變區(qū)的缺失突變體，探究不同區(qū)域缺失對病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，NSP2298-592、726-819、421-565、300-467、324-467、734-797位氨基酸缺失不能拯救到病毒，519-565位氨基酸缺失病毒復(fù)制能力顯著下降，NSP2421-467位氨基