1、豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起嚴(yán)重威脅豬養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一。20世紀(jì)80年代末至90年代初，該病最早在美國(guó)和歐洲等國(guó)家暴發(fā)和流行。PRRSV的主要特點(diǎn)是變異快、重組率高，這給PRRSV的防控帶來(lái)巨

2、大的挑戰(zhàn)，而詳盡研究并了解PRRSV的生物學(xué)特性，對(duì)于PRRSV的防控具有重要意義。
　　根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PRRSV ORF1a區(qū)與ORF1b區(qū)共編碼14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp)(Fang and Snijder,2010)(Fang and Snijder,2010)。其中Nsp1與PRRSV的亞基因組mRNAs的合成相關(guān)。Nsp2與Nsp3參與復(fù)制相關(guān)復(fù)合體DMVs(double membrane vesicle

3、s)的形成。目前研究認(rèn)為，PRRSV病毒的復(fù)制在DMVs上進(jìn)行。Nsp4編碼3C樣絲氨酸蛋白酶。除此之外，Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11被證實(shí)與PRRSV抑制天然免疫信號(hào)通路相關(guān)。ORF1b區(qū)域編碼4個(gè)Nsps(Nsp9至Nsp12)，Nsp9是RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，Nsp10是RNA解旋酶，已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道證實(shí)Nsp9與Nsp10是高致病性PRRSV的致病基礎(chǔ)。Nsp11具有核酸內(nèi)切酶活性與去泛素化酶活

4、性，此外Nsp11具有抑制NLRP3炎癥小體與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。在整個(gè)ORF1b區(qū)域，唯有Nsp12的功能尚不明確，并未見(jiàn)其相關(guān)報(bào)道。
　　Nsp12含153aa，其分子量為17kDa，位于ORF1b區(qū)末端，能夠提高IL-1β和IL-8的表達(dá)。除此之外，HSP70是研究比較明確的與Nsp12相互作用的蛋白質(zhì)。抑制HSP70的表達(dá)能夠顯著降低病毒mRNA的合成及病毒的復(fù)制。本研究主要對(duì)Nsp12對(duì)病毒復(fù)制的影響及相關(guān)的生化特性進(jìn)行

5、分析。通過(guò)對(duì)不同PRRSV毒株間的Nsp12序列進(jìn)行保守性分析;在感染性克隆的基礎(chǔ)上構(gòu)建Nsp12的缺失病毒，探索其對(duì)復(fù)制的影響;對(duì)Nsp12二聚化的現(xiàn)象及二硫鍵的特性進(jìn)行相關(guān)的探索;在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的復(fù)制子系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對(duì)Nsp12是否參與病毒RNA的合成等問(wèn)題進(jìn)行相關(guān)的研究。研究表明，不同PRRSV毒株間Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性。Nsp12缺失不能夠拯救病毒，表明Nsp12參與進(jìn)PRRSV的復(fù)制并且對(duì)于PRRSV的復(fù)制至

6、關(guān)重要。生化分析結(jié)果顯示Nsp12容易被氧化形成二聚體及多聚體，Nsp12與N蛋白的二聚體形成都是由于細(xì)胞裂解后空氣氧化形成二硫鍵，與N蛋白不同的是，Nsp12二聚體不存在于成熟的病毒粒子中。對(duì)Nsp12中3個(gè)半胱氨酸突變分析表明，第35位和79位Cys聯(lián)合突變不能拯救出病毒，說(shuō)明第35位和79位Cys對(duì)于PRRSV的復(fù)制至關(guān)重要。最后，構(gòu)建了可以評(píng)價(jià)PRRSV負(fù)鏈RNA合成能力的復(fù)制子系統(tǒng)，并通過(guò)該系統(tǒng)初步證明只有ORF1a和ORF1