1、端粒酶因可在細胞內通過其逆轉錄酶活性復制和延長染色體末端的端粒重復序列（TTAGGG）而廣為人知。其可使細胞克服因每次有絲分裂而造成的端?？s短，因此在細胞的永生化中扮演著重要的角色。人端粒酶活性的表達由端粒酶主要組成部分之一--端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的轉錄水平所調控。由于hTERT僅在大部分惡性腫瘤組織中特異性表達，而正常組織中（造血干細胞，生殖細胞除外

2、）一般無表達，故通過抑制hTERT表達從而抑制端粒酶活性可能成為腫瘤治療的特異性靶點。靶向hTERT的基因治療與目前認可的治療方法相比，將具有更少的毒性副反應。 過去認為，單純針對端粒酶的抑制劑由于端粒需要一定的時間才能縮短至可以誘發(fā)細胞衰老死亡的臨界長度，故其治療效果有一定的滯后性，且療程的長短在很大程度上依賴于治療起始時細胞端粒的長度以及細胞有絲分裂的周期長短。但與此不符的是，許多針對hTERT和端粒酶的研究都顯示，一旦hT

3、ERT表達受抑，腫瘤細胞可以很快出現凋亡，且并不一定伴有端粒長度的明顯改變。提示抑制端粒酶活性可能通過某種未知的機制，導致腫瘤細胞遵循另一條不依賴端粒長度損耗的“快速通道”而迅速走向死亡。由于抑制hTERT表達的抗腫瘤機制尚不明確，目前報道其在不同腫瘤細胞中的作用也各不相同，故有必要針對不同組織學類型的腫瘤進行具體的研究。 p53是在多條生長相關通路包括凋亡、細胞周期阻滯以及衰老中扮演關鍵角色的腫瘤抑制基因，已證實其可以通過抑

4、制Sp1與hTERT啟動子結合而下調hTERT的轉錄活性。但直到最近才有報道顯示hTERT的過度表達或抑制也可以立即對p53的表達產生負性或正性的影響，且不伴有細胞端粒長度的改變，提示在hTERT與p53之間可能存在一定的反饋通路，hTERT可能通過某種端粒以外的效應作用于自身的細胞周期調節(jié)基因，而不需要依賴端粒長度的縮短。目前尚無研究顯示由hTERT表達改變所引起的p53轉錄活性改變是否與導致細胞死亡的“快速通道”相關，但由于p53與

5、凋亡的密切相關性，我們推測抑制hTERT表達所引起的細胞快速死亡可能與p53的表達改變有關。 研究目的：本研究的目的是檢測hTERT基因表達沉默后能否引起多種卵巢癌細胞生長的快速抑制和死亡，并探討這種現象與p53基因表達激活的相關性。我們旨在在含有不同p53狀態(tài)的卵巢癌細胞中，探索抑制hTERT表達發(fā)揮效應的快速作用模式，并希望對此過程的更深刻理解能夠為發(fā)現對hTERT抑制劑敏感或抵抗的原因提供新的線索，為卵巢癌的治療提供新的思

6、路。 研究方法：本研究構建了兩個靶向hTERT的發(fā)夾狀RNA干擾質粒pG1和pG2，和一個由與人類基因無同源性的隨機序列組成的對照質粒pGCR，并將其在體外和體內分別轉染入含不同p53狀態(tài)的三株端粒酶陽性卵巢癌細胞中，包括含野生型p53的A2780細胞、含突變型p53的OVCAR3細胞和缺乏p53表達的SKOV3細胞。 在體外實驗中，A2780，OVCAR3和SKOV3細胞分別進行了pG1，pG2質粒的轉染，以pGCR質

7、粒和未處理的細胞作為對照。hTERT的抑制效率分別通過實時熒光定量RT-PCR和免疫印跡進行了驗證，轉染后細胞的端粒酶活性則以TRAP法進行檢測。采用CCK-8檢測細胞的生長情況，流式細胞儀進行細胞周期分析。細胞凋亡情況則采用AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染和TUNEL法分別進行了檢測，以免疫印跡檢測p53和其下游基因p21的表達情況。 在動物實驗中，將A2780和SKOV3細胞注射至裸鼠皮下以構建移植瘤模型。成瘤后隨機分為

8、3組，予以干擾質粒pG2、亂序質粒pGCR以及生理鹽水分別瘤內注射，隔日一次共2周。每次注射前測量腫瘤大小，治療完畢后完整剝離腫瘤稱重并制成石蠟切片行HE染色進行形態(tài)學觀察，采用TUNEL及電鏡檢測細胞凋亡情況，以免疫印跡法檢測hTERT表達抑制情況，p53及p21的表達則采用免疫組化進行檢測。 研究結果：1.酶切及測序結果顯示重組質粒pG1、pG2和pGCR構建成功。實時熒光定量RT-PCR、免疫印跡和TRAP分析顯示靶向hT

9、ERT的發(fā)夾狀RNA干擾質粒能夠有效地抑制卵巢癌細胞中hTERT mRNA和蛋白的表達并抑制端粒酶活性。 2.體外實驗中，沉默hTERT基因表達能夠引起三株卵巢癌細胞快速的生長抑制，細胞周期分析顯示抑制hTERT表達主要通過將細胞周期阻滯在S期而導致細胞生長減慢。其中兩株細胞株，A2780和OVCAR3，在hTERT表達受抑后均很快出現了明顯的凋亡，同時伴隨著p53和p21表達的增高。相反的是，沉默hTERT基因在缺乏p53基因

10、表達的SKOV3細胞中并未導致明顯的凋亡，其p21基因表達也較對照組降低。 3.成功構建A2780和SKOV3細胞裸鼠皮下移植瘤。與注射pGCR和生理鹽水組相比，重組質粒pG2在體內能夠顯著減慢兩種細胞移植瘤的生長，減小腫瘤體積并減輕腫瘤重量。在A2780細胞移植瘤中出現了大量的凋亡和壞死，同時p53和p21的表達也明顯增強。但在SKOV3細胞移植瘤中僅觀察到大片狀的壞死，細胞凋亡不明顯，p21的表達較對照組相比沒有明顯改變。未

11、發(fā)現治療后的裸鼠有明顯的毒副反應。 結論：針對hTERT的發(fā)夾狀RNA干擾質粒在體內外均能有效地和特異地沉默卵巢癌細胞hTERT基因的表達、降低端粒酶活性并迅速引起腫瘤細胞的生長抑制。但在含有不同p53狀態(tài)的細胞系中，其引起細胞死亡的機制并不相同，抑制hTERT表達所立即引起的卵巢癌細胞凋亡與其引起抑癌基因p53及p21上調有關。我們再一次證實了在通過使端粒逐漸縮短而引起細胞衰老死亡的“經典途徑”以外，抑制端粒酶活性還可以通過另