1、目的:檢測(cè)女性盆腔器官脫垂(POP)患者子宮主韌帶和陰道前壁中鈣蛋白酶(calpain)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)的表達(dá)，探討兩種蛋白表達(dá)變化與POP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　 材料與方法:
　　 一、材料
　　 32例子宮脫垂患者的主韌帶、膨出陰道前壁全層組織及17例非脫垂患者的主韌帶及陰道前壁全層組織來自2007年10月到2009年10月間中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科手術(shù)切除的組織。所有組織平均

2、分成兩份，一份經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，另一份放入1.5ml Eppendorf管中液氮保存。
　　 二、主要試劑
　　 免疫組化：calpain-2兔抗人單克隆抗體及calpastatin兔抗人單克隆抗體購自Santa公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及S-P試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。
　　 RT-PCR:Trizol試劑購自Invitrogen公司，PCR引物序列由上海生工生物公司合成，RT-P

3、CR試劑盒購自TAKARA公司，DL-2000 Marker購自大連寶生物工程公司。
　　 三、方法
　　 （一）免疫組織化學(xué)染色:按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法行免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：細(xì)胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。光鏡下在每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0，無陽性區(qū)域；1，陽

4、性區(qū)域面積1-20％;2，陽性區(qū)域面積20-50％;3，陽性區(qū)域面積＞50％。0-1:為calpain-2或calpastatin陰性表達(dá)；2-3: calpain-2或calpastatin陽性表達(dá)。
　　 (二)RT-PCR
　　 1、RNA的提取:從液氮中取出標(biāo)本，Trizol法提取總RNA（按100mg組織加1ml Trizol）。
　　 2、RT反應(yīng):取已提取RNAlμl加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液里進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成

5、cDNA(反應(yīng)體系為10μl)。
　　 3、PCR擴(kuò)增calpain-2引物：上游引物5′-AGC CAT TGC CTC CCT CAC-3′，下游引物5′-CCA CCC ACT CGC CGT ATT-3′；calpastatin引物：上游引物5′-ACC ATC TAA GCC AAC T-3′，下游引物5′-TTC ACG GTC TTC TTC T-3′；內(nèi)參照物采用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，上游引物5’-GT

6、G GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’，下游引物5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增程序按以下條件設(shè)定：94℃40s，退火30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)。β-actin、calpain-2及calpastatin退火溫度分別為55℃，55.5℃，56℃。所有基因擴(kuò)增前94℃預(yù)變性3min，擴(kuò)增后72℃延伸7min。
　　 4、電泳: PCR產(chǎn)物各5μl

7、經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照，進(jìn)行圖象分析。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，calpain-2或calpastatin的蛋白表達(dá)和POP的關(guān)系用卡方檢驗(yàn)；脫垂組及對(duì)照組之間calpain-2及calpastatin mRNA的比較用T檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、calpain-2或calpastatin蛋白在主韌帶及陰道前壁組

8、織中的表達(dá)情況
　　 1、calpain-2陽性表達(dá)于細(xì)胞漿，在POP組患者主韌帶及陰道前壁組織calpain-2陽性表達(dá)水平分別為71.9％、78.1％。而在對(duì)照組陽性表達(dá)水平分別為23.5％、29.4％。二者有顯著性差異。
　　 2、calpastatin亦表達(dá)于細(xì)胞漿，calpastatin的表達(dá)水平在脫垂組主韌帶及陰道前壁組織中的陽性表達(dá)率分別為25.0％、21.9％，低于對(duì)照組分別為58.8％、76.5％，統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)分析兩組的差異有顯著性。
　　 二、calpain-2及calpastatin mRNA在主韌帶及陰道前壁組織中的表達(dá)情況
　　 通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，calpain-2及calpastatin在主韌帶及陰道前壁組織中均有表達(dá)。在主韌帶及陰道前壁中，脫垂組calpain-2mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脫垂組calpastatin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組有降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。