1、糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabeticneuropathicpain,DNP)又稱疼痛性糖尿病外周神經(jīng)病變(painfuldiabeticperipheralneuropathy,PDN)是臨床最常見的神經(jīng)病理性疼痛類型之一，臨床表現(xiàn)相當(dāng)復(fù)雜，可出現(xiàn)自發(fā)痛、痛覺過敏、觸誘發(fā)痛和其他不典型的感覺異常。糖尿病神經(jīng)病理痛也是一種機制獨特且復(fù)雜的慢性疼痛，但是目前對這類特異病痛的發(fā)生機制了解較少，臨床上也缺乏有效的治療手段，這也成為長時期以來疼

2、痛研究領(lǐng)域關(guān)注的一大難點之一。糖尿病神經(jīng)病理痛嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給患者身心帶來了巨大痛苦。近年來，隨著診斷技術(shù)的進步以及治療方案的改良，如何改善糖尿病患者的生活質(zhì)量已成為急需解決的問題。因此，進一步探討糖尿病神經(jīng)病理痛特別是早期糖尿病神經(jīng)病理痛的發(fā)生發(fā)展機制，尋找緩解糖尿病神經(jīng)病理痛的有效途徑，改善糖尿病患者的生活質(zhì)量，具有重大而又廣泛的臨床價值和社會意義，這也是當(dāng)今國際疼痛研究領(lǐng)域的熱點難點問題。
　　鏈脲佐菌素(stre

3、ptozocin,STZ)誘發(fā)I型糖尿病的動物模型能夠很好地模擬臨床上糖尿病患者癥狀，是一種典型的神經(jīng)病理性疼痛模型。以前的觀點認為，C類纖維(C纖維)的功能僅僅是通過動作電位的方式忠實的傳遞外界傷害性信息，而沒有對傷害性信息進行整合、加工。然而，最近人們對C類纖維的功能有了新的認識。C類纖維不但可以傳遞傷害性信息，還可以在傳遞的過程中同時對傷害性信息的信號進行加工、處理、整合。此外，大量研究表明神經(jīng)異位放電是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和維持的

4、重要機制之一。Hong等人發(fā)現(xiàn)在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion,DRG)神經(jīng)元給予持續(xù)閾上機械刺激后可以記錄到DRGC類神經(jīng)元出現(xiàn)高頻放電，提示C類神經(jīng)元高頻放電與早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺過敏發(fā)生可能有著密切聯(lián)系。此外，Levine實驗室證明在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠C類纖維中大約三分之一無髓鞘C纖維對機械刺激反應(yīng)具有超敏感性特點，并且C纖維放電頻率出現(xiàn)三倍增加，結(jié)果提示外周傷害

5、性感受器中C類纖維和DRGC類神經(jīng)元興奮性和可塑性變化可能是誘導(dǎo)早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠產(chǎn)生傷害性感受感覺的主要原因。此外，有研究發(fā)現(xiàn)C類纖維中炎性因子或介質(zhì)活化可以提高軸突膜興奮性并且還可調(diào)節(jié)C纖維高頻的動作電位序列的發(fā)放，損傷的C類神經(jīng)纖維能夠改變原有的軸突傳導(dǎo)速度減慢(conductionvelocityslowing,CVs)現(xiàn)象，這些結(jié)果提示C類纖維的膜興奮性在炎癥因子的影響下有了顯著的提高。結(jié)合最近我室朱志茹博士在正常生

6、理情況下家兔的隱神經(jīng)上觀察到傳導(dǎo)丟峰(conductionfailure)現(xiàn)象,并且傳導(dǎo)丟峰也可以改變C類纖維原有的軸突傳導(dǎo)速度減慢(CVs)過程，因而，外周C纖維可能是在傷害性信息傳遞的同時進行加工、處理、整合。那么，我們猜想在一些早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛病理情況下在C類纖維和DRGC類神經(jīng)元，伴隨著傳導(dǎo)丟峰發(fā)生的同時是否發(fā)生可塑性和興奮性的改變，發(fā)生這些變化的機制是什么？
　　我室王秀超碩士在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)

7、C纖維上應(yīng)用在體單纖維分離技術(shù)記錄大鼠尾神經(jīng)單根C纖維放電序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予持續(xù)的閾上機械刺激（100g,持續(xù)60s），早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠大鼠尾神經(jīng)單根C纖維對機械刺激的反應(yīng)性較對照組大鼠顯著增強。此外，向尾神經(jīng)C纖維施加不同頻率的重復(fù)電刺激（2、5、10Hz），結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維與對照組相比傳導(dǎo)丟峰程度顯著降低，給予低濃度河豚毒素(tetrodotoxin,TTX,100nM)后可以逆轉(zhuǎn)糖尿病神經(jīng)

8、病理痛大鼠尾神經(jīng)單根C纖維傳導(dǎo)丟峰減少現(xiàn)象，提示鈉通道在傳導(dǎo)丟峰過程中發(fā)揮著重要作用，但這種現(xiàn)象的內(nèi)在機制大家了解甚少。
　　此外，我室孫薇博士以糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中C類神經(jīng)元為研究對象，應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄capsaicin陽性小型神經(jīng)元的放電情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元興奮性顯著增高，表現(xiàn)為鈉電流增大，給予TTX(100nM)后發(fā)現(xiàn)可以對放電情況有顯著抑制。結(jié)果提示鈉通道在C類神經(jīng)元發(fā)

9、生了可塑性的變化。鈉通道通過怎樣的機制發(fā)揮作用呢？為此，我們重點觀察早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元和C類神經(jīng)元發(fā)出的C纖維中鈉通道Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9的表達改變來探討興奮性增加和可塑性變化的機制。
　　主要結(jié)果如下：
　　選用注射STZ后3-4周，具有機械性痛敏和熱痛敏的早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對照組大鼠進行以下實驗。
　　基于上述放電現(xiàn)象的變化，我們進一步采用免疫熒光染色、we

10、sternblot方法觀察在鈉通道蛋白Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達改變。
　　1.Nav1.7在尾神經(jīng)C類纖維和DRGC類神經(jīng)元胞體的表達情況。實驗發(fā)現(xiàn)Nav1.7作為一種典型的TTX敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在對照組大鼠DRG中大約有42±6％的peripherin(C類纖維和C類神經(jīng)元特異標(biāo)記物)陽性的神

11、經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.7。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有92±3％peripherin陽性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.7。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強度為24.5±4.7，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強度為50.5±4.0

12、。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的C纖維的熒光強度為15.5±4.2，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的C纖維的熒光強度為43.0±5.5。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p

13、<0.05)。此外，Westernblot結(jié)果半定量分析顯示，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對照組相比Nav1.7離子通道蛋白表達量在尾神經(jīng)和DRG神經(jīng)元均明顯升高，而β-Actin則無明顯差異(n=4,p<0.05)。
　　2.Nav1.8在尾神經(jīng)C類纖維和DRGC類神經(jīng)元胞體的表達情況。實驗發(fā)現(xiàn)Nav1.8作為一種典型的TTX不敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在

14、對照組大鼠DRG中大約有48±7.7％的peripherin陽性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.8。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有77±6％peripherin陽性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.8。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強度為28.8±7.3，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peri

15、pherin與Nav1.8共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強度為71.8±7.43。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的C纖維的熒光強度為16.3±2.8，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的C纖維的熒光強度為39.2±8.7。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病

16、神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外，Westernblot結(jié)果半定量分析顯示，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對照組相比Nav1.8離子通道蛋白表達量在尾神經(jīng)和DRG神經(jīng)元均明顯升高，而β-Actin則無明顯差異(n=4,p<0.05)。
　　3.Nav1.9在尾神經(jīng)C類纖維和DRGC類神經(jīng)元胞體的表達情況。實驗發(fā)現(xiàn)Nav1.9作為一種典型的TTX不敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性

17、疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在對照組大鼠DRG中大約有41±6％的peripherin陽性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.9。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有82±8％peripherin陽性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.9。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光

18、強度為19.4±1.9，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強度為36.2±6.72。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的C纖維的熒光強度為10.1±2.5，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記

19、的C纖維的熒光強度為29.4±2.7。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強度較對照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。
　　結(jié)論：以上結(jié)果顯示在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類神經(jīng)元發(fā)出的C類纖維和DRGC類神經(jīng)元的鈉通道Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9表達顯著上調(diào)。結(jié)果提示，鈉通道的表達上調(diào)可能是傷害性信息在C類纖維傳遞過程中發(fā)生加工、處理、整合的細胞分子機制。同樣，鈉通道表達上調(diào)可