1、【背景及目的】
　　糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種臨床上常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病,由于長期的高血糖狀態(tài)常常會導(dǎo)致周圍神經(jīng)發(fā)生病理性改變而表現(xiàn)出明顯的糖尿病神經(jīng)病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)。DNP是DM患者危害最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,部分患者在受到機械刺激時會出現(xiàn)顯著的異常疼痛,稱之為糖尿病機械性痛(diabetic mechanical allodynia,DMA

2、),DMA嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。然而由于對DMA發(fā)生發(fā)展的分子機制尚無全面認(rèn)識,目前仍缺乏針對其有效的治療措施。因此,本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備的DMA模型大鼠為基礎(chǔ),采用分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和行為藥理學(xué)等方法,在疼痛信號的“起搏器”背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)和脊髓水平,研究機械性敏感的TRP通道TRPV1、TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1隨DMA發(fā)生

3、發(fā)展的時空表達(dá)變化,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其拮抗劑對DMA的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。實驗旨在揭示DMA發(fā)病的分子機理,為臨床治療提供新思路和實驗依據(jù)。
　　【方法】
　　(1)建立DM大鼠模型;
　　(2)應(yīng)用von Frey絲測定DM模型大鼠機械性后爪回縮閾值(paw withdrawal threshold,PWT)的變化,篩選DMA模型大鼠;
　　(3)應(yīng)用Hargreaves熱輻射法測定DM模型大鼠熱刺激后爪回縮潛伏期

4、(paw withdrawal latency,PWL)的變化,篩選DM熱痛模型大鼠;
　　(4)運用實時定量PCR方法檢測DMA模型大鼠DRG中TRPV1的mRNA表達(dá)變化;
　　(5)運用Western blot方法檢測DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV1蛋白表達(dá)變化;
　　(6)運用免疫熒光染色方法觀察DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中TRPV1的表達(dá)變化;
　　(7)運用免疫熒光雙重染色觀察DMA模型

5、大鼠DRG中TRPV1與NF200、CGRP和IB4雙標(biāo)細(xì)胞的比例變化;
　　(8)DMA模型大鼠鞘內(nèi)置管,在DMA14 d單次注射不同劑量的RR或CPZ,測定給藥后不同時間點模型大鼠的PWT,并計算RR的半數(shù)有效劑量(ED50);
　　(9)DMA模型大鼠鞘內(nèi)置管,從DMA14 d至20 d連續(xù)注射不同劑量的RR或CPZ,測定大鼠PWT;
　　(10)運用實時定量PCR方法檢測DMA模型大鼠DRG中TRPV4、TRP

6、C1、TRPC6和TRPA1的mRNA表達(dá)變化;
　　(11)運用Western blot方法檢測DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1蛋白質(zhì)的表達(dá)變化;
　　(12)運用免疫熒光染色方法觀察DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中 TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1的表達(dá)變化;
　　(13)運用免疫熒光雙重染色觀察DMA模型大鼠DRG中TRPV4、TRPC1、TRPC6和T

7、RPA1與NF200、CGRP和IB4雙標(biāo)細(xì)胞的比例變化;
　　(14)DMA模型大鼠鞘內(nèi)置管,在DMA7 d單次注射不同劑量的SKF96365,分別測定給藥后不同時間點大鼠的PWT,并計算SKF96365的ED50;
　　(15)根據(jù)RR和SKF96365的ED50,計算聯(lián)合用藥劑量并鞘內(nèi)注射給藥,測定給藥后不同時間點大鼠的PWT;
　　(16)運用PCR方法檢測無機械痛有熱痛的DM模型大鼠DRG中TRPV1、TRP

8、V4、TRPC1、TRPC6和TRPA1的mRNA表達(dá)變化;
　　(17)無機械痛有熱痛的DM模型大鼠鞘內(nèi)置管,在DMA14 d分別給予ED50劑量的RR和SKF96365,測定不同藥物在注射后不同時間點大鼠的PWL。
　　【結(jié)果】
　　(1)在DM模型大鼠造模后3 d觀察到血糖水平顯著升高,體重增長明顯緩慢;
　　(2)造模后7 d,約50％的DM模型大鼠雙側(cè)后爪出現(xiàn)明顯的機械性觸誘發(fā)痛(diabetic me

9、chanical allodynia,DMA;<8 g,DMA模型大鼠);
　　(3)造模后7 d,約90%的DM模型大鼠出現(xiàn)明顯的PWL延長(>8 s);
　　(4)DMA模型大鼠DRG中TRPV1 mRNA的表達(dá)在DMA7 d和14 d明顯增多;
　　(5)DMA狀態(tài)下,DRG和脊髓背角中TRPV1蛋白分別在14 d和7 d開始上調(diào),二者不完全匹配;
　　(6)免疫熒光染色結(jié)果顯示,DMA14 d組模型大鼠D

10、RG的TRPV1陽性細(xì)胞和脊髓背角的TRPV1陽性終末均明顯增多,且在DRG中TRPV1陽性細(xì)胞的大小比率隨DMA進(jìn)程發(fā)生改變;
　　(7)雙重免疫熒光標(biāo)記顯示,DMA模型大鼠DRG中增多的TRPV1陽性細(xì)胞主要是CGRP陽性的肽能神經(jīng)元;
　　(8)鞘內(nèi)單次注射RR或CPZ均具有明顯的劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用,RR的鎮(zhèn)痛作用出現(xiàn)較晚(4 h),但維持時間長,而CPZ則相反;
　　(9)鞘內(nèi)連續(xù)注射RR或CPZ均能顯著上調(diào)D

11、MA模型大鼠降低的機械性痛閾值,鎮(zhèn)痛效應(yīng)呈劑量依賴性,且RR比CPZ的累積效應(yīng)更明顯;
　　(10)DMA模型大鼠DRG中其他機械敏感性TRP通道的mRNA表達(dá)上調(diào)時間不同:TRPV4在DMA14 d,TRPC1在DMA28 d,TRPC6在DMA7 d,而TRPA1在DMA21 d和28 d;
　　(11)在DMA模型大鼠的DRG和脊髓背角中,除TRPC1的蛋白質(zhì)顯著增多的時間比其mRNA的變化晚1 w外,其余3種TRP通

12、道的蛋白質(zhì)表達(dá)與其各自mRNA的變化時程基本一致;
　　(12)免疫熒光染色結(jié)果表明這四種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布模式不盡相同,TRPC6和TRPA1呈均勻分布,而 TRPC1和TRPV4呈局域化分布;此外,DMA狀態(tài)下增多的TRP蛋白有在較大直徑細(xì)胞中分布增多的趨勢;
　　(13)免疫熒光雙重染色顯示,在 DMA模型大鼠中增多的TRP陽性神經(jīng)元的性質(zhì)不同:TRPV4和TRPA1主要為CGRP陽性的肽能神經(jīng)元,TRPC1是NF20

13、0陽性的大型神經(jīng)元,而TRPC6則是IB4陽性的非肽能神經(jīng)元;
　　(14)鞘內(nèi)單次注射SKF96365具有劑量依賴性的鎮(zhèn)痛作用,其鎮(zhèn)痛作用出現(xiàn)較快(2 h),但維持時間短;
　　(15)鞘內(nèi)聯(lián)合注射RR和SKF96365能顯著緩解DMA模型大鼠的機械性痛行為,具有起效早,維持時間長的協(xié)同作用;
　　(16)在無機械痛僅有熱痛的DM模型大鼠DRG中TRPV1和TRPV4的mRNA表達(dá)明顯上調(diào),而TRPC1、TRPC6和

14、TRPA1則沒有明顯變化;
　　(17)對僅有熱痛的DM模型大鼠鞘內(nèi)注射RR或SKF96365,只有RR能緩解熱痛敏,而SKF96365卻無效。
　　【結(jié)論】
　　(1)DNP模型大鼠的機械性痛和熱痛并不匹配,約50%的DM模型大鼠兼具機械痛和熱痛,而90%左右的DM模型大鼠具有熱痛,尚有約10%的大鼠處于無痛狀態(tài)。因此針對此模型的相關(guān)研究,尤其是進(jìn)行基因表達(dá)研究時一定要注意疼痛形式的甄別和嚴(yán)格動物分組,以免結(jié)果偏差。

15、
　　(2)DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV1表達(dá)在DMA14 d顯著增多,且機械性痛敏能被其拮抗劑RR和CPZ抑制,提示TRPV1是與機械性痛的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的重要分子。
　　(3)DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1表達(dá)在DMA的不同時程點均呈現(xiàn)增高趨勢,且非特異性拮抗劑RR和SKF96365能顯著抑制DMA模型大鼠的機械性痛行為,提示糖尿病機械性痛的產(chǎn)生和維持是一個復(fù)雜的

16、過程,五種TRP通道在不同階段參與DMA的發(fā)展:TRPC6在觀察范圍內(nèi)的早期階段、TRPV1和TRPV4在中期、TRPC1和TRPA1在晚期發(fā)揮作用。因此,在DRG中DM的機械痛產(chǎn)生如熱痛一樣具有感受機械性刺激的分子譜系。
　　(4)與DMA的TRP通道機制不同,在僅出現(xiàn)熱痛的糖尿病動物DRG中,TRPV1和TRPV4的表達(dá)明顯上調(diào),而TRPC1、TRPC6和TRPA1的表達(dá)沒有明顯變化;鞘內(nèi)給予RR能產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng),而SKF