1、研究背景和目的：
　　 宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌的主要病因。表觀遺傳學(xué)事件在癌癥的發(fā)生過程中起著重要的作用，幾乎所有的癌癥類型均表現(xiàn)出異常的甲基化狀況，且涉及全基因組。本研究旨在分析臨床樣本中HPV16病毒長控制區(qū)增強(qiáng)子（LCR Enhancer）和E6基因啟動(dòng)子（E6promoter）兩段序列中的11個(gè)位點(diǎn)（7533、7551、7674、7680、7

2、692、7860、31、37、43、52、58）的甲基化圖譜，結(jié)合患者的臨床資料，分析病毒DNA甲基化程度差異與臨床病變程度的相關(guān)性，初步探討甲基化程度差異與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為今后從分子生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)角度闡明HPV致病機(jī)制，進(jìn)而預(yù)測患者宮頸病變的進(jìn)展及預(yù)后等相關(guān)問題提供研究基礎(chǔ)。
　　 研究方法和步驟：
　　 所用的TCT標(biāo)本均來自2009年11月至2010年6月在北京協(xié)和醫(yī)院門診就診的宮頸病變及常規(guī)婦科檢查的

3、患者，一共收集TCT標(biāo)本324例，其中HPV感染244例，用多對(duì)引物PCR擴(kuò)增分型后確定單一型別HPV感染146例，混合感染98例。其中單一HPV16感染51例（ASCUS6例，正常5例，LSIL7例，HSIL19例，SCC14例）。在對(duì)原始標(biāo)本提取DNA后，從單一HPV16感染中選擇26例、從混合感染中選擇4例（HPV16感染為主，細(xì)胞學(xué)診斷均為正常），總計(jì)30例樣本納入全程研究。其中正常組6例（4例為混合感染），LSIL組7例，HS

4、IL組10例，SCC組7例。另從醫(yī)科院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心購得SiHa細(xì)胞系1株作為平行對(duì)照。SCC組全部病例和HSIL組部分病例有北京協(xié)和醫(yī)院病理科的病理診斷。
　　 從原始樣本中提取DNA，然后用試劑盒對(duì)提取的DNA行重亞硫酸鹽修飾，再用BSP引物PCR擴(kuò)增目的片段，在電泳驗(yàn)證目的片段存在后，將PCR產(chǎn)物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E..coli克隆，隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)克隆，對(duì)目的片段進(jìn)行測序，從而確定目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀況。
　　

5、 采用描述性和圖表的方法來匯總分析數(shù)據(jù)，根據(jù)圖譜可以直觀的反映出CpG位點(diǎn)的甲基化頻率。同時(shí)采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。組間甲基化率差異比較用Fisher精確概率檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各位點(diǎn)的甲基化率用Student's t檢驗(yàn)，顯著高于0（與0比較P<0.05）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)中一共測序確定了1013個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀況，一共有45個(gè)CpG位點(diǎn)

6、發(fā)生甲基化，總體甲基化率為4.4％。在11個(gè)CpG位點(diǎn)中，位點(diǎn)7533、7551、7680、7860均未測得甲基化發(fā)生，位點(diǎn)7674、7692的總體甲基化率約為2％，位點(diǎn)31、37、43、52、58的總體甲基化率約為8％。
　　 2、絕大多數(shù)的甲基化都發(fā)生在SCC組。SCC組在7674、31、37、43、52、58位點(diǎn)上發(fā)生了明顯的甲基化，7674位點(diǎn)甲基化率約為8％，余各位點(diǎn)甲基化率在20％以上，均顯著高于0（Student’

7、s t檢驗(yàn)，P<0.0001）。SCC組與HSIL組間甲基化率差異顯著（P<0.01，F(xiàn)isher精確概率檢驗(yàn)）。
　　 3、正常組和LSIL組甲基化現(xiàn)象罕見，但由于樣本量限制，正常組/LSIL組與HSIL組/SCC組間無法進(jìn)行有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　 4、測定了1株SiHa細(xì)胞的5個(gè)拷貝的甲基化情況，在LCR Enhancer序列的5個(gè)位點(diǎn)有甲基化發(fā)生。
　　 結(jié)論：
　　 1、在LCR Enhanc