1、背景與目的 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(Gluocose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency，簡稱G6PD缺乏癥)[MIM305900]是世界上最常見的單基因遺傳病之一，也是我國南方地區(qū)人群中常見的血液遺傳病之一，世界范圍內(nèi)約有4億人受累。G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳，男性半合子G6PD活性呈顯著性缺乏，女性雜合子酶活性變化范圍較大，可呈顯著性降低，也可在正常范圍。G6PD基因定位于

2、xq28，全長約20kb，含13個外顯子和12個內(nèi)含子，編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥的分子基礎多表現(xiàn)為單個堿基置換的錯義突變，導致氨基酸置換，使G6PD活性降低，還未發(fā)現(xiàn)大片段缺失、無義突變和移碼突變。目前全世界已報道了150多種G6PD基因突變型，突變的分布具有種族和地區(qū)異質(zhì)性。迄今為止在東南亞人群中發(fā)現(xiàn)30種G6PD基因突變型，在我國人群中發(fā)現(xiàn)的突變有25種，其中1388G>A、1376G>T和95A>G是最常見的突變，約占總

3、突變的70％以上。由于方法學的限制，我國以往對該病的研究主要是采取基于男性患者的調(diào)查策略(the male patient-based investigation)，即以表型陽性的男性樣本鑒定G6PD缺乏癥的發(fā)生率及其基因突變譜，幾乎未涉及該病的基因型和表型關(guān)系分析。廣西是一個有著4.9千萬人口的少數(shù)民族地區(qū)，該地區(qū)G6PD缺乏癥的流行病學資料尚不清楚，特別是女性攜帶者和病人的資料幾乎不了解。 本研究采用基于人群的分子分析策略(

4、the population-based molecularanalysis)，完成了對該地區(qū)人群的G6PD缺乏癥發(fā)生率、突變譜、表型與基因型關(guān)系和單倍型的分析，以及女性的系統(tǒng)分子鑒定。設計與方法用于本研究的樣本共4,704例(其中男性2,368例，平均年齡29.45±5.06歲；女性2,336例，平均年齡26.52±3.89歲)，于2002年10月至2003年10月期間于柳州市婦幼保健院婚檢門診采集，被檢者就診時均無貧血表現(xiàn)。這些樣品

5、98.5％是來自于中國南方地區(qū)，其中94.8％的樣本的祖籍地來自廣西壯族自治區(qū)14個不同地區(qū)，無血緣關(guān)系。隨機選取的樣本中漢族和壯族人群的比例與廣西全區(qū)二者的比重相同，分別占64.3％(3,027/4，704，漢族)和32.5％(1,528/4，704，壯族)，其余149例樣品來自其他少數(shù)民族。正常對照129例，其中男性64例，年齡：23～42，平均年齡29.91±3.29，G6PD/6PGD比值為：1.62～1.79(1.73±0.1

6、1)；女性65例，年齡：23～34，平均年齡27.48±2.56，G6PD/6PGD比值為：1.58～1.93(1.65±0.09)。 本研究提出并建立了表型篩查與基因型分析結(jié)合的系統(tǒng)分子鑒定流程：采用傳統(tǒng)的高鐵血紅蛋白還原試驗(methemoglobin reduction test，MetRT，檢測標準為：MetHb％>75％為陰性；MetHb％=75％，為陽性)進行初篩，然后用WHO推薦的G6PD/6PGD比值法(診斷標準

7、為：比值>1.5為陰性；比值=1.5為陽性)進行檢測，接著我們把所有經(jīng)過檢測高鐵血紅蛋白還原試驗為陽性的樣品(或者說經(jīng)過G6PD/6PGD比值法確診為表型陽性的樣品和所有疑似樣品)用標準方法抽提基因組DNA，通過引物延伸/變性高效液相色譜(primerextension/Denaturing High Performance Liquid Chromatographty，PE/DHPLC)技術(shù)進行基因型分析，該技術(shù)能同時檢測10種東南亞

8、地區(qū)常見G6PD基因突變型(95 A>G 392 G>T，487 G>A，493 A>G 592 C>T，871 G>A，1024 C>T，1360 C>T,1376 G>T和1388 G>A)和一種多態(tài)性位點(1311 C>T)，最后，為了檢測是否存在新突變或其他突變類型，我們對PE/DHPLC技術(shù)未檢測出的陰性樣本進行G6PD基因12個外顯子和外顯子-內(nèi)含子結(jié)合區(qū)的直接測序。此外，我們從高鐵血紅蛋白還原試驗檢測為陰性的4，263例樣

9、品中隨機選取129例樣品作為正常對照組，用PE/DHPLC技術(shù)檢測其G6PD基因突變的情況，在65例女性樣品中發(fā)現(xiàn)兩例常見突變類型(1376 G>T和1388 G>A)，為了驗證這部分女性樣品是否還存在其他G6PD基因突變類型，我們同時對其進行DNA測序。本研究診斷G6PD缺乏癥的標準主要包括：(1)高鐵血紅蛋白還原試驗(MetRT)和G6PD/6PGD比值法檢測為表型陽性；或者(2)用PE/DHPLC技術(shù)或DNA測序進行基因分析檢測出

10、陽性突變。 結(jié)果與討論 本研究共檢測出G6PD缺乏癥陽性樣品361例，其中男性個體176例，因此廣西壯族自治區(qū)G6PD缺乏癥基因頻率為7.43％；女性個體185例，該地區(qū)漢族人群的突變基因頻率(16.38％，249/1，520)與壯族人群(15.39％，117/760)比較無統(tǒng)計學差異(X<'2>=2.368，P>0.05)。我們從上述361例樣品中鑒定出320例個體有陽性基因突變，共27種不同基因型，包括8種半合子、1

11、3種雜合子和6種純合子，此外，還有41例(15例男性和26例女性)表型陽性的樣品未發(fā)現(xiàn)任何突變。我們對G6PD基因突變譜鑒定結(jié)果顯示，1388G>A(G6PD Kaiping)，1376G>T(G6PD Canton)，95A>G(G6PD Gaohe)，1024C>T(Chinese-5)和871G>A(G6PD Viangchan)等5種突變?yōu)樵摰貐^(qū)人群的常見突變，占G6PD缺陷等位基因的85％，另外檢測到10種(392G>T，44

12、2G>A，1004C>T，202G>A，592C>T，519C>T，196T>A，703C>T，202G>A/871G>A和1414A>C)少見突變，約占突變?nèi)旧w的4％。在這些變異中，有6種為中國人首次報道的突變，其中4種為我們研究發(fā)現(xiàn)的新突變，它們是442G>A(G6PD Liuzhou)，703C>T(G6PD Nanning)，141 4A>C(G6PD Laibin)和202G>A/871G>A(G6PD Hechi)；另二種

13、稀有突變，196T>A和202G>A曾分別在泰國和日本人中報告過。此外，我們根據(jù)G6PD/6PGD比值表型指標的變化，將女性三種常見突變(分別為1376G>T，1388G>A和95A>G)雜合子的相同基因型樣品進一步分為陽性組(G6PD/6PGD=1.5)和陰性組(G6PD/6PGD>1.5)，兩兩比較這3種相同基因型各自配對的陽性組與陰性組之間的表型差異，結(jié)果顯示MetHb％和G6PD/6PGD比值在三配對資料二組之間均有顯著差異(P

14、=0.000，P<0.05)，本研究提示，即使是在相同突變時，女性雜合子的G6PD酶活性存在很大的變異性。根據(jù)Lyon學說，女性的兩個G6PD等位基因，有一個處于失活狀態(tài)，即隨著酶缺乏的紅細胞與正常的紅細胞嵌合的差異，女性雜合子具有不同的表現(xiàn)度，這與該病不完全顯性的遺傳方式相吻合。分組比較的統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，表型指標高鐵血紅蛋白還原率(MetHb％)和G6PD/6PGD比值在女性雜合子組(MetHb％：43.22±17.42；G6PD

15、/6PGD：1.33±0.40；n=164)和男性半合子(MetHb％：29.63±15.12；G6PD/6PGD：0.50±0.31；n=176)有顯著差異(P=0.000，P<0.05)；女性雜合子組(同上)和純合子組(MetHb％：33.16±6.34；G6PD/6PGD：0.57±0.24；n=21)有顯著差異(P=0.000，P<0.05)；而男性半合子組和女性純合子組之間無統(tǒng)計學差異(MetHb％：P=0.272，P>0.0

16、5；G6PD/6PGD：P=0.310，P>0.05)；正常對照組(正常參考值為MetHb％：88.10±5.23；G6PD/6PGD:1.70±0.11；n=129，男性64例，女性65例，無性別差異，P=0.121，P>0.05)與上述雜合子、純合子和半合子各組間均有差異(P=0.000，P<0.05)。同時從129例表型“正常”樣品中經(jīng)過測序檢測出3例突變(1376G>T，1388G>A和1414A>C)，這提示了包括常見變異在內(nèi)

17、的許多隱性突變體很可能隱藏在“正常”雜合子個體中，而被一般表型篩查所漏檢，只有采用直接分子篩查才可以鑒定這類突變。我們對176例男性G6PD缺陷染色體和6例女性新突變?nèi)旧w的單倍型進行了202A(NlaⅢ)，376G(Fok I)，1116G(Pst)，1311T(Bcl I)，內(nèi)含子11-93C(NalⅢ)等5個多態(tài)性位點的分析，結(jié)果表明182個缺陷染色體中的94％為單倍型(——+——)，提示常見的nt95A>G，1024C>T，13