1、研究背景： 砂仁是姜科植物陽春砂Amomumvillosumlour.、海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu.或綠殼砂Amomumvillosumlour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen的干燥成熟果實。以廣東陽春縣所產(chǎn)陽春砂最著名，稱為地道南藥砂仁。砂仁在中醫(yī)治療胃腸道疾病中應(yīng)用非常普遍，具有確切的醫(yī)療價值，可治療胃和十二指腸潰瘍、腸炎、小兒腹痛、慢性腹瀉、胃痛、腹瀉、腹脹、胃無力

2、等胃腸道疾病。砂仁含揮發(fā)油高達1.7-3％，因此砂仁研究重點多為其揮發(fā)油成份。 近年來對砂仁的化學(xué)成分和藥理活性研究日趨深入，但對治療胃腸道疾病的作用機理尚未明確。國內(nèi)對砂仁治療胃腸道疾病的文獻報道很多，大多集中于砂仁對胃腸道動力影響的觀察，對藥理機制的研究也僅見砂仁對胃腸激素影響的檢測。本研究將以胃潰瘍(GU)和炎癥性腸病(IBD)兩種疾病為研究的切入點，從其細胞和分子機制出發(fā)，探討砂仁揮發(fā)油對胃腸黏膜炎癥的作用和免疫藥理機制

3、。 胃潰瘍是發(fā)生于賁門和幽門之間的潰瘍黏膜缺損超過黏膜肌層的一種消化性潰瘍，在人群中發(fā)病機率很高。胃黏膜損傷和潰瘍的形成伴隨著生長因子在黏膜的表達，致炎細胞因子的誘生，以及血管活性物質(zhì)、一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素的產(chǎn)生。胃潰瘍的愈合是一個非常復(fù)雜的過程，涉及到壞死物質(zhì)的清除，肉芽組織的生長，細胞移行、分化、增殖和細胞外基質(zhì)形成，新生血管生成，纖維組織和疤痕組織的形成以及上皮重構(gòu)等過程。有研究表明，一些與胃酸分泌、細胞移行、分化、增

4、殖和細胞外基質(zhì)形成及新生血管生成有關(guān)的細胞因子和生長因子參與了潰瘍的愈合，另外氧自由基和NO在潰瘍的損傷和愈合中也起著很重要的作用。 炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是一種以腸道炎癥和黏膜組織損傷為特征的腸道非特異性炎癥疾病，其產(chǎn)生的腸內(nèi)、腸外癥狀嚴重影響了病人的生活質(zhì)量，其發(fā)病率和癌變率在我國逐年上升。IBD的確切病因未明，但有充分的證據(jù)表明：易感基因、環(huán)境因素和黏膜免疫系統(tǒng)之間的復(fù)雜交互效應(yīng)是引起IBD的主要原因。目前

5、，免疫因素在IBD的發(fā)病學(xué)中最為肯定，很多證據(jù)表明循環(huán)和腸道局部細胞因子表達異常與IBD的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。與IBD關(guān)系密切的有致炎細胞因子和抗炎細胞因子，致炎細胞因子和抗炎細胞因子功能、數(shù)量異?；騼深愐蜃又g的失衡，可引起和放大黏膜的炎癥，進一步加重腸黏膜的損傷。此外，腸上皮細胞和淋巴細胞的凋亡也參與了IBD的發(fā)病過程，IBD患者的結(jié)腸黏膜凋亡細胞數(shù)異常增多導(dǎo)致潰瘍病變的形成，因此在IBD的發(fā)病機制中凋亡可能具有重要意義。

6、研究目的： 本研究采用水蒸氣蒸餾法從陽春砂仁中提取出揮發(fā)油成分，對建立的胃潰瘍和結(jié)腸炎兩種動物模型采用灌胃給藥法治療，觀察砂仁揮發(fā)油對損傷黏膜愈合的影響，以及循環(huán)和腸道局部的細胞因子和生長因子的水平、胃腸道相關(guān)炎癥介質(zhì)的變化以及腸黏膜細胞凋亡的變化，探討砂仁對慢性胃腸道疾病的抗炎作用和免疫藥理機制，為砂仁在胃腸道疾病的治療奠定基礎(chǔ)，進而為將砂仁開發(fā)為有效的臨床制劑提供理論基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法： (一)砂仁揮發(fā)油

7、的提取、質(zhì)量控制和急性毒性實驗研究 采用水蒸氣蒸餾法從陽春砂果實中提取揮發(fā)油成分，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析砂仁揮發(fā)油的化學(xué)組成，并采用氣相色譜法(GC)檢測砂仁中乙酸龍腦酯的含量，以此作為揮發(fā)油的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。另外，我們對砂仁揮發(fā)油進行了小鼠的急性毒性實驗，以確定砂仁揮發(fā)油的半數(shù)致死量(LD50)，為藥理評價提供劑量設(shè)計的依據(jù)。 (二)砂仁揮發(fā)油對乙酸性胃潰瘍大鼠的治療作用及其免疫機理研究 采用

8、乙酸直接接觸漿膜的方法建立乙酸性胃潰瘍的動物模型，將50只大鼠隨機分為正常對照組、胃潰瘍模型組、法莫替丁組、砂仁揮發(fā)油高劑量組和砂仁揮發(fā)油低劑量組，每組10只。造模后第3d開始給藥，正常組和模型組給予0.9％氯化鈉溶液90mg/(kg·d)，法莫替丁組給予法莫替丁4mg/(kg·d)，砂仁揮發(fā)油高、低劑量組分別給予砂仁揮發(fā)油乳劑300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。給藥10d后處死，觀察砂仁揮發(fā)油對胃潰瘍大鼠的大體形態(tài)學(xué)、潰

9、瘍面積和體重的影響，并觀察其對胃潰瘍大鼠的組織病理學(xué)方面的影響，同時檢測大鼠外周血中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)濃度和一氧化氮(NO)濃度的變化。采用液相芯片(luminex)技術(shù)檢測了砂仁揮發(fā)油對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)在胃潰瘍大鼠外周血清中的變化，并使用免疫組化方法對表皮生長因子(EGF)在大鼠胃黏膜組織中的表達情況進行了觀察，來探討砂仁揮發(fā)油對胃潰瘍大鼠

10、胃黏膜的作用機理。 (三)砂仁揮發(fā)油對大鼠實驗性結(jié)腸炎慢性炎癥期的治療作用及其免疫機理研究將58只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、結(jié)腸炎模型組、SASP組、砂仁揮發(fā)油高劑量組和砂仁揮發(fā)油低劑量組。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌腸法制作大鼠實驗性結(jié)腸炎模型，造模后第7d開始給藥。正常組和模型組給予0.9％氯化鈉溶液0.09g/(kg·d)，陽性對照組給予柳氮磺吡啶片(SASP)4mg/(kg·d)，砂仁揮發(fā)油劑量

11、組給予砂仁揮發(fā)油乳劑300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。給藥14d后處死，通過觀察砂仁揮發(fā)油對各組大鼠的生存率、結(jié)腸宏觀表現(xiàn)、病理學(xué)變化、結(jié)腸濕重、大體損傷分數(shù)、腹瀉和粘連的情況，評價其對結(jié)腸黏膜損傷愈合的影響；檢測結(jié)腸組織中髓過氧化物酶(MPO)活性、SOD活性及MDA含量的變化，以判斷炎癥的嚴重程度和砂仁揮發(fā)油抗氧化的作用。并用luminex技術(shù)同時檢測結(jié)腸中的三種細胞因子：白介素-2(IL-2)、IL-4和TNF-α

12、水平的影響，采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)法檢測揮發(fā)油對結(jié)腸黏膜細胞凋亡的影響，探討砂仁揮發(fā)油對IBD作用的相關(guān)機制。 (四)統(tǒng)計學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組檢測結(jié)果計量資料采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，并進一步做多重比較。生存率的比較采用x2檢驗(Chi-SquareTest)。顯著性水平為：α=0.05。 結(jié)果結(jié)論： 1

13、.本實驗采用水蒸氣蒸餾法從陽春砂仁中提取揮發(fā)油，其得率為3.54％，在提取的砂仁揮發(fā)油中，共分離出96個化學(xué)成分，鑒定出其中63個成分，已鑒定的成分占揮發(fā)油總量的98.08％。主要為單萜類和倍半萜類化合物，還有非萜類小分子的芳香族和脂肪族化合物。揮發(fā)油中含量大于1％的有乙酸龍腦酯、樟腦、檸檬烯、樟腦烴、龍腦、β-蒎烯、β-月桂烯和α-蒎烯8種化合物。急性毒性實驗得出砂仁揮發(fā)油對小鼠灌胃的LD50為7200mg/Kg，按毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，屬實

14、際無毒類物質(zhì)。 2.砂仁揮發(fā)油對胃潰瘍大鼠的潰瘍愈合具有促進作用?？梢愿纳莆笣兇笫缶癫徽瘛⒕氲∈扰P的癥狀，減輕胃潰瘍大鼠胃黏膜的組織病理學(xué)損傷。砂仁高、低劑量組均可以提高大鼠血清SOD值、NO含量和VEGF含量，減少大鼠血清MDA值；砂仁揮發(fā)油低劑量組的大鼠血清中IL-4水平顯著提高，砂仁高、低劑量組對血清中TNF-α水平?jīng)]有顯著影響。EGF的表達部位在胃黏膜腺體的頸部，以壁細胞、頸部細胞胞漿表達為主，砂仁揮發(fā)油的高、低劑量

15、組的大鼠EGF表達均為陽性。 3.砂仁揮發(fā)油對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎癥具有改善作用?？梢越档痛笫蠼Y(jié)腸濕重和大體損傷分數(shù)，改善大鼠腹瀉的情況；同時減輕結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜的病理組織學(xué)損傷。砂仁揮發(fā)油低劑量組可提高結(jié)腸SOD活性和MPO活性，同時使MDA含量顯著下降；砂仁揮發(fā)油高、低劑量組可下調(diào)造模后大鼠結(jié)腸黏膜中升高的致炎細胞因子TNF-α和IL-2的水平，并且上調(diào)抗炎細胞因子IL-4的水平；砂仁揮發(fā)油可降低大鼠結(jié)腸黏膜過度增多的凋亡

16、細胞數(shù)目，凋亡主要發(fā)生在病變處及臨近的非病變處隱窩上皮細胞。 綜上所述，本課題在建立胃潰瘍和炎癥性腸病兩種動物模型的基礎(chǔ)上，采用陽春砂仁揮發(fā)油灌胃給藥，觀察其對上述兩種胃腸黏膜炎性疾病的作用，并從免疫學(xué)角度探討其作用機制。研究結(jié)果表明：砂仁揮發(fā)油對大鼠乙酸性胃潰瘍和實驗性結(jié)腸炎均具有緩解炎癥和促進潰瘍愈合的作用，其機制可能和清除過量氧自由基，調(diào)控致炎和抗炎細胞因子的平衡，促進胃黏膜生長因子EGF的表達，以及下調(diào)結(jié)腸的異常細胞凋亡