1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，越來越多的研究表明惡性腫瘤發(fā)生過程與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)水平的改變具有密切聯(lián)系。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測基因表達(dá)水平的方法，對于腫瘤的發(fā)病機(jī)理研究、早期診斷和治療具有重要意義。本論文設(shè)計(jì)了具有特異識別功能的熒光分子探針，發(fā)展了在基因水平上定量研究腫瘤細(xì)胞p53mRNA表達(dá)與點(diǎn)突變檢測的體系，主要開展了以下三方面的研究工作：1、根據(jù)p53抑瘤基因的堿基序列，設(shè)計(jì)了能特異性檢測p53mRNA的分子信

2、標(biāo)(molecularbeacon，MB)，發(fā)展了一種快速定量測定細(xì)胞內(nèi)總RNA提取物中p53mRNA的方法。采用鼻咽癌細(xì)胞系(CNE2)和經(jīng)RNA干擾技術(shù)降低p53基因表達(dá)的細(xì)胞系(CNE2-p53RNAi)為樣本，抽提其總RNA并用MB檢測。建立了p53/cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其應(yīng)用于多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53基因表達(dá)水平的分析，表達(dá)變化趨勢與經(jīng)典的mRNA分析方法RT-PCR檢測結(jié)果相符。這種方法簡單、靈敏、快速、安全，可以用于不同細(xì)胞中

3、p53mRNA的體外定量檢測。 2、根據(jù)已建立的分子信標(biāo)定量檢測p53mRNA的方法，考察了用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用不同時(shí)間后肺腺癌細(xì)胞(A549)中p53mRNA表達(dá)水平的變化，并結(jié)合傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法研究該基因轉(zhuǎn)錄水平變化對細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制，驗(yàn)證了分子信標(biāo)快速檢測mRNA方法的可靠性和實(shí)用性。結(jié)果表明：藥物作用后能誘導(dǎo)A549細(xì)胞中p53mRNA表達(dá)上調(diào)，且作用6小時(shí)后p53mRNA表達(dá)最高，但隨著藥物作用時(shí)間

4、的進(jìn)一步增加，p53mRNA表達(dá)降低。該方法快速、準(zhǔn)確、成本低，能夠快速地獲知該藥物對細(xì)胞內(nèi)p53mRNA表達(dá)影響的信息，有望為腫瘤的個(gè)體化治療快速、準(zhǔn)確地提供合理用藥的參考依據(jù)。 3、根據(jù)p53基因的堿基序列設(shè)計(jì)熒光基團(tuán)四甲基羅丹明標(biāo)記的核酸探針(熒光探針)和熄滅基團(tuán)4'-(4'-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸標(biāo)記的核酸探針(熄滅探針)，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理和RNaseH能降解RNA與DNA雜交體中RNA模板這一特點(diǎn)，發(fā)展了一種