1、目的：明確枸杞多糖（LBP）對糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的保護作用，進一步探討枸杞多糖通過調(diào)控ROCK信號通路及其底物P-MLC的表達，減少血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的作用機制。
　　 材料與方法：實驗一.取健康雄性SD大鼠60只，隨機分為3組：CON組：正常對照組；DM組： STZ造模；LBP組： STZ造模成模后予以LBP（250mg/Kg·d）灌胃，DM組予以等量的生理鹽水灌胃。分別于4w、8w、12w抽取靜脈血，并取眼球。實驗二.

2、健康成年雄性（SD）大鼠54只，分組及給藥方法取材時間同實驗一，采用HE染色光鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜各層組織細胞數(shù)量及形態(tài)變化。實驗三.健康成年雄性（SD）大鼠44只，隨機分為5組，CON組、DM組、LBP組給藥方法取材時間同實驗一，F(xiàn)組：成模后法舒地爾（Fasudil）腹腔注射（15mg/kg），L+F組：成模后LBP灌胃+Fasudil腹腔注射，各組于8w取材。分別用免疫組織化學方法檢測Occludin、ROCK1表達情況進行半定量分

3、析。實驗四.實驗細胞RF/6A，MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，按照1:2～1:4進行傳代。分組檢測：共分5組，正常對照組：含葡萄糖5.5mmol/L；高糖1組：含葡萄糖30mmol/L；高糖2組：含葡萄糖40mmol/L；LBP+高糖1組：含葡萄糖30mmol/L+LBP（1g/L）；LBP+高糖2組：含葡萄糖40mmol/L+LBP（1g/L）；于1d、3d、5d、7d進行指標檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.LBP對DM

4、大鼠血糖、血脂及血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的影響：
　　 （1）血糖變化：LBP干預后的各組大鼠對應(yīng)同時期的DM大鼠的血糖均有明顯下降，4w時血糖下降幅度為57％，8w時下降幅度為40％，12w血糖下降幅度為36％，其降血糖效果以4w最為明顯，隨著病情的進展LBP的降糖效果有所減弱，下降率基本穩(wěn)定在35％～40％之間。
　　 （2）體重的變化：DM組成模后，開始出現(xiàn)消瘦，體重下降或增加緩慢，明顯低于相同時間段的其他兩組大鼠的體重

5、。而LBP組則體重與正常對照組比較略有下降，明顯好于DM組。
　　 （3）血脂的變化：DM組12w時甘油三酯基本達到正常值的3倍，而LBP組12w時甘油三酯的濃度有輕度上升。12w時DM組總膽固醇濃度是正常對照組的1.4倍；而LBP組膽固醇濃度與正常組基本無差異p>0.05。
　　 （4）EB在血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的變化：DM組大鼠EB滲漏量4w、8w、12w分別增加了2.1倍、2.3倍、2.7倍。而枸杞多糖組較糖尿病組以

6、上三個時間點EB滲透量降低了50％、40％、27％，組間比較p<0.01。前4w保護作用表現(xiàn)就的最明顯。
　　 2.LBP對DM大鼠血-視網(wǎng)膜屏障形態(tài)學變化的影響：
　　 （1）HE染色光鏡觀察:12wDM組神經(jīng)纖維層斷裂明顯；節(jié)細胞、內(nèi)顆粒層細胞排列明顯紊亂；毛細血管明顯擴張，數(shù)量增加。4wLBP組、8wLBP組各層組織形態(tài)與正常組織基本無明顯差別，12wLBP組僅出現(xiàn)內(nèi)、外顆粒層排列稍有不規(guī)則，毛細血管的輕度擴張。<

7、br>　　 （2）視網(wǎng)膜血管鋪片:12w DM組毛細血管網(wǎng)迂曲，扭結(jié)，某些部位出現(xiàn)節(jié)段性膨大，管腔狹窄甚至閉塞。周細胞和內(nèi)皮細胞有所減少；12wCON、DM、LBP組VEGF灰度值216.13±2.71、105.30±4.25、176.72±4.31。組間有明顯差異p<0.05，DM組并隨著病程的進展，VEGF表達的量不斷增高。
　　 （3）電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變:12w DM組大鼠視網(wǎng)膜基底膜進一步增厚，血管內(nèi)皮細胞及周細胞腫

8、脹，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹變性，管腔可出現(xiàn)擴張。視桿細胞膜盤模糊，出現(xiàn)溶解、斷裂，間隙進一步擴大。12w LBP胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體輕度腫脹變性，基底膜增厚不明顯，毛細血管壁完整，管腔無擴張。視桿細胞，膜盤結(jié)構(gòu)略有些模糊，結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)紊亂，但紋理尚清。
　　 3.枸杞多糖對糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障保護作用機理的研究：
　　 （1）免疫組化法檢測的Occludin表達：主要分布在視網(wǎng)膜內(nèi)五層上?；叶戎?2w時，CON組143.70±

9、2.29；DM組173.18±3.78；LBP組153.02±3.59，DM組表達較正常對照組顯著減少。隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變時間的延長而逐漸下降。8w各治療組與DM組比較，Occludin表達量明顯增加。F+L組效果最好（p<0.05），LBP與Fasudil組之間無明顯差異（p>0.01）。
　　 （2）免疫組化法檢測的ROCK1表達：主要分布在神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)顆粒層，灰度值12w時，CON組178.32±5.92；DM組15

10、5.91±2.76；LBP組178.82±4.33，DM組從4w開始減弱，并隨著病程的延長，ROCK1表達的量逐漸增加，而LBP組ROCK表達量并沒有明顯的增加。各治療組間比較，F(xiàn)+L組與正常組無明顯差異（p>0.05），治療效果最好，F(xiàn)asudil組的作用要比LBP的效果明顯一些（p<0.05）。
　　 （3）免疫印跡法檢測Occludin蛋白表達：DM組隨著病程的延長，Occludin蛋白的量逐漸下降，組間有明顯差異p<0.

11、01，而LBP組3.57±0.58；F組3.65±0.71；F+L組4.48±0.53，LBP組與F組比較LBP組表達略低，但無明顯統(tǒng)計學意義P>0.05。F+L組表達量高于其他兩治療組p<0.01，與CON組相接近。
　　 （4）免疫印跡法檢測ROCK1蛋白表達：各組DM組大鼠ROCK蛋白表達隨著病程的延長量逐漸上升，組間有明顯差異p<0.01；而LBP組3.14±0.51；F組3.05±0.42；F+L組2.62±0.51，

12、LBP組與F組比較LBP組表達略高，有統(tǒng)計學意義p<0.05。F+L組表達量高于其他兩治療組p<0.01，與CON組相接近。
　　 （5）免疫印跡法檢測P-MLC蛋白表達：各組DM組大鼠ROCK蛋白表達隨著病程的延長量逐漸上升，組間有明顯差異p<0.01，而LBP組2.97±0.42；F組2.78±0.53；F+L組2.44±0.47，LBP組與F組比較LBP組表達略高，有統(tǒng)計學意義p>0.05。F+L組表達量高于其他兩治療組p

13、<0.01，與CON組相接近。
　　 4.枸杞多糖對高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜血管皮細胞Rho/ROCK信號傳導通路的影響：
　　 （1）正常RF/6A呈單層扁平上皮狀，高糖2組7d組內(nèi)皮細胞收縮明顯，有的伸出長長的偽足，邊界模糊，細胞間形成明顯的裂隙，細胞生長數(shù)量明顯較對照組少。高糖1組則于5d后形態(tài)開始出現(xiàn)變化。而LBP+高糖1組、LBP+高糖2組，僅于7d時，細胞略有些變圓，細胞數(shù)量略少。
　　 （2）RF/6As單

14、層通透性的變化：3、5、7 d高糖組HRP的光密度值明顯高于正常對照組（p<0.01），尤其高糖2組滲漏更加明顯。而LBP則能逆轉(zhuǎn)這種因高糖造成的滲漏（p<0.01）。尤以LBP+高糖1組效果較理想，與對應(yīng)的高糖1組通透性明顯降低（p<0.01）。
　　 （3）F-actin形態(tài)及分布的變化：對照組F-actin分布均勻，呈網(wǎng)狀有序排列，細胞相互融合，連接緊密。高糖2組7d外周致密帶明顯斷裂，胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)力纖維斷裂，細胞周邊出現(xiàn)“絨

15、毛狀”短的指狀突起，“空洞狀”裂隙增大，細胞近似脫落狀態(tài)。LBP+高糖2組7d外周致密帶進一步變細，并且部分出現(xiàn)斷裂，細胞間開始出現(xiàn)裂隙，但細胞形態(tài)明顯好于高糖7d組。
　　 （4）ROCK1蛋白表達量：隨葡萄糖濃度的增加而升高，與β-actin的光密度比值，正常組0.54±0.25、高糖1組0.85±0.31、高糖2組1.32±0.38，高糖1組和高糖2組與對照組比較p<0.01，而這種增高趨勢能被LBP所逆轉(zhuǎn)，在葡萄糖濃度為

16、30mmol/L的條件下LBP抑制ROCK1表達的作用更明顯。
　　 （5）P-MLC蛋白表達量：表達量隨葡萄糖濃度的增加而升高，與β-actin的光密度比值，正常組1.34±0.25、高糖1組2.45±0.31、高糖2組3.32±0.38，高糖1組和高糖2組與對照組比較p<0.01，LBP抑制P-MLC表達的升高，LBP+高糖1組1.38±0.27，LBP+高糖2組1.87±0.51。
　　 （6）Occludin蛋白

17、表達量：隨著葡萄糖濃度的增加Occludin蛋白表達量逐漸下降，LBP-高糖1組0.90±0.16，LBP-高糖2組0.69±0.14，各治療組均可明顯提升其相對應(yīng)高糖組Occludin表達的量，有明顯統(tǒng)計學意義p<0.01，尤其LBP-高糖1組可明顯抑制Occludin表達的量的下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.LBP可以顯著減低糖尿病大鼠的血糖、血脂并能降低血-視網(wǎng)膜屏障的滲漏。
　　 2.LBP可以減低糖尿病

18、大鼠的視網(wǎng)膜血管上VEGF的表達，并能減輕血管內(nèi)皮細胞和周細胞的水腫，減少基底膜的增厚，并減輕視細胞的損害。
　　 3.DR的過程中確實存在著ROCK通路的激活，ROCK及其底物P-MLC表達的上調(diào)。而該過程可以被LBP所阻斷，減低以上信號分子的表達，通過穩(wěn)定Occludin的表達，起到保護血-視網(wǎng)膜屏障的作用。
　　 4.LBP可以明顯減輕體外高糖環(huán)境培養(yǎng)下的單層EC的滲漏，通過抑制ROCK及其底物P-MLC該信號通路