1、目的：
　　胃癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，近年來，胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍然被列為全球第四大最常見的癌癥，其死亡率一直居高不下，占全球癌癥相關(guān)的死亡數(shù)第二位，嚴(yán)重威脅人體的健康。雖然早期診斷和治療有所進(jìn)展，但胃癌患者根治性手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是一種主要的導(dǎo)致死亡原因，預(yù)后難以令人滿意?，F(xiàn)在可用于胃癌預(yù)后的因素中，最重要的因素是胃癌術(shù)后TNM分期，然而，即使是處于同一分期的胃癌患者預(yù)后也存在顯著差異。因此尋找判斷

2、胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志并加以干預(yù)是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，丙酮酸脫氫酶(PDH)是以復(fù)合物的形式存在于在線粒體基質(zhì)中，能夠催化葡萄糖衍生的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-輔酶A，乙酰-輔酶A然后進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán);在腫瘤細(xì)胞中，PDH活性受到抑制，而使腫瘤的代謝形式由線粒體的氧化磷酸化轉(zhuǎn)為有氧糖酵解。因此，在能量代謝過程中，PDH作為糖酵解和線粒體糖氧化之間聯(lián)系通道的開關(guān)酶。但人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其除了參與能量代謝化反應(yīng)外，還與

3、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。然而，PDH在腫瘤中表達(dá)的變化鮮見報(bào)道。PDH作為一個(gè)能量代謝鏈上的一個(gè)至關(guān)重要的酶，其失活或表達(dá)缺失可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　乳酸脫氫酶A(LDH-A)是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶，在糖酵解過程中的最后階段乳酸生成的過程中起著至關(guān)重要的作用。目前有報(bào)道，過量的乳酸生成預(yù)示著胃癌患者不良的預(yù)后。因此， LDH-A作為糖酵解通路的關(guān)鍵酶，它的表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及患者的惡性預(yù)后密切相關(guān)。

4、
　　本文將應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)胃癌組織及癌周正常胃粘膜組織中PDH、LDH-A的表達(dá)與意義，并探討其表達(dá)變化與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。與此同時(shí)，綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，采用RNA干擾技術(shù)，以質(zhì)粒為載體構(gòu)建靶向LDH-A的siRNA，轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞BGC-823干擾LDH-A的表達(dá)，觀察抑制LDH-A的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生長特征的影響，進(jìn)一步佐證LDH-A的表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的影響，希望為下一步的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5、>　　方法：
　　一、檢測(cè)胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中PDH、LDH-A的表達(dá)
　　（一）資料收集
　　收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科2006年1月至2007年5月手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁非癌組織265例。研究對(duì)象包括194名男性和71名女性，平均年齡為59（范圍29-81）歲，選取的所有患者術(shù)前均未接受化療、放療。收集所有患者的超過五年的隨訪信息。組織標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋后，切片常規(guī)伊紅-蘇木素染色

6、后用于病理診斷，將選取的胃癌及癌周石蠟組織手工制成組織芯片(20×10)，4μm連續(xù)切片。培養(yǎng)正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1和胃癌MKN28、AGS、 SGC-7901、BGC-823細(xì)胞系。
　?。ǘ┟庖呓M化、Western blot檢測(cè)
　　行StreptAvklin-Biotin Complex法（SABC法）免疫組化分析。采用卡方檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法、log-rank檢驗(yàn)、Cox回歸等統(tǒng)計(jì)方法分析PDH、L

7、DH-A蛋白表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義，在正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1和胃癌MKN28、AGS、 SGC-7901、BGC-823細(xì)胞系中檢測(cè)LDH-A蛋白表達(dá)情況。
　　二、LDH-A對(duì)細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響
　?。ㄒ唬└蓴_載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　1、針對(duì)LDH-A的ORF序列設(shè)計(jì)三條siRNA序列和一條陰性對(duì)照序列，分別構(gòu)建表達(dá)這三個(gè)序列和陰性對(duì)照序列的pGPU6-GFP-siL

8、DH-A重組質(zhì)粒。
　　2、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000介導(dǎo)，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入人胃癌BGC-823細(xì)胞（LDH-A高表達(dá)細(xì)胞系），同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和野生對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24h熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率;48h倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　?。ǘ└蓴_載體對(duì)LDH-A在胃癌細(xì)胞中表達(dá)的影響
　　采用Western blot半定量檢測(cè)方法從蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染后siRNA對(duì)LDH-A的抑制效果。

9、
　?。ㄈ└蓴_載體（干擾LDH-A的表達(dá)）對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響
　　1、采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siLDH-A重組質(zhì)粒對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖活性的影響，分別計(jì)算轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、60h細(xì)胞的生長率，觀察重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞生長增殖的影響。
　　2、采用劃痕法Wound healing assay細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siLDH-A重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞BGC-82

10、3遷移能力的改變。
　　3、采用Transwell法基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siLDH-A重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲能力的改變。
　　結(jié)果：
　　免疫組化染色顯示PDH蛋白定位于細(xì)胞漿，在胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)陽性率為55.47％，與癌旁非癌組織的53.58％無顯著差異(P＞0.05)。PDH表達(dá)與勞倫斯分型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴管浸潤，組織學(xué)類型和TNM分期有關(guān)(P＜0.05)。生存分析Ka

11、plan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)表明，PDH在胃癌組織中高表達(dá)患者預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)者(P＜0.001)。多因素分析（校正協(xié)變量包括年齡、Lauren分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、腫瘤大小、腫瘤的侵襲深度和淋巴管浸潤）顯示PDH的表達(dá)在胃癌是一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素(Hazard ratio=0.608，95％CI0.504-0.734,P＜0.001)。
　　免疫組化顯示LDH-A蛋白定位于細(xì)胞漿，在胃癌原發(fā)

12、灶中的表達(dá)陽性率為76.14％，高于癌旁非癌組織62.68％(P=0.002)。LDH-A高表達(dá)與勞倫斯分型，和組織學(xué)類型相關(guān)(P＜0.05)。生存分析Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)表明，在彌散型胃癌和未分化胃癌中，高表達(dá)LDH-A胃癌患者預(yù)后明顯低于低表達(dá)者(P＜0.001)，而腸型胃癌及分化型胃癌中生存曲線未見上述趨勢(shì)。多因素分析（校正因素包括年齡、Lauren分型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、腫瘤大小

13、、腫瘤的侵襲深度和淋巴管浸潤）顯示LDH-A在胃癌的表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(Hazard ratio=1.829，95％CI1.375-2.4330，P＜0.001)。利用Western blot檢測(cè)了正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1和MKN28、AGS、SGC-7901、BGC-823胃癌細(xì)胞株LDH-A基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示LDH-A在AGS、BGC-823胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)顯著高表達(dá)，在MKN28及SGC-7901胃癌細(xì)胞株中呈中等量表

14、達(dá)。而在非胃癌細(xì)胞株GES-1中LDH-A表達(dá)不顯著。DNA測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了針對(duì)LDH-A基因的三條小干擾RNA重組質(zhì)粒載體包括pGPU6-GFP-siLDH-A(980，506，376);重組質(zhì)粒作用BGC-823細(xì)胞48h后，形態(tài)學(xué)可見野生組BGC-823，細(xì)胞貼壁生長旺盛，邊界清楚，呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)，可見較多的核分裂相，而轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siLDH-A的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞貼壁能力下降、密度降低、細(xì)胞變變圓、小、顆

15、粒增多、碎片增加、并有脂滴形成。對(duì)照組細(xì)胞與野生型細(xì)胞形態(tài)上未見明顯差別。轉(zhuǎn)染效率約為40-60％。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞中LDH-A的表達(dá)發(fā)揮了干擾作用，其中以LDH-A-siRNA(506)載體的干擾效果最強(qiáng)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示pGPU6-GFP-siLDH-A-506重組質(zhì)粒對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制效應(yīng)，從轉(zhuǎn)染后24h開始細(xì)胞增殖受到抑制，48時(shí)細(xì)胞增殖

16、受抑制極為明顯(p＜0.01);劃痕法Wound healing assay細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siLDH-A重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞BGC-823遷移能力明顯減弱;Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-siALDH-A重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞BGC-823，發(fā)現(xiàn)侵襲能力比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞減弱。
　　結(jié)論：
　　為了評(píng)價(jià)PDH表達(dá)的臨床意義，我們采用大批量胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果在2

17、56例患者胃癌組織中PDH表達(dá)有差異。盡管機(jī)制尚不清楚，卻有足夠的理由推斷PDH作為一個(gè)能量代謝鏈上的一個(gè)至關(guān)重要的酶，其低表達(dá)可能與腫瘤的侵襲發(fā)展有關(guān)。此外，PDH表達(dá)也可以作為一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，其降低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。
　　LDH-A在胃癌組織中顯著高表達(dá)，與癌組織周圍正常黏膜組織有著差異。PDH蛋白表達(dá)升高與患者較高年齡和較低的組織學(xué)分化程度相關(guān)，而與其它臨床病理特征如勞倫斯分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病

18、分期無關(guān)。生存分析表明LDH-A高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了LDH-A的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體，并在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株BGC-823(LDH-A基因高表達(dá)細(xì)胞株)，采用Western blot、MTT、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，比較研究了LDH-A基因沉默后對(duì)胃癌細(xì)胞生長增殖、凋亡和運(yùn)動(dòng)力的影響。結(jié)果表明，LDH-A蛋白在部分胃癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)。構(gòu)建的LDH-A-shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體能特異