1、了解滴南省2008年手足口病病原體流行特征，獲得一株EV71分離株的全基因組核苷酸序列并對其進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)生樹，獲得該EV71毒株的基因型。
　　 材料與方法
　　 收集2008年河南省18個地市在門診就診和住院的手足口臨床診斷病例的血清和/或糞便(咽拭子、皰疹液、腦脊液)標本，運用國家CDC推薦的分子生物學方法對其進行鑒定；同時選取部分標本接種人橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)進行病毒分離。提取其中一株EV71分

2、離毒株的RNA，設計八對引物，用反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription PCR即RT-PCR)擴增其全基因組序列，產(chǎn)物純化后另外設計八對引物對其進行雙向測序；用Clustal(1.8)X、GeneDoc、DNAStar、MEGA3等軟件進行核苷酸整理、拼接組裝、校對、同源性比較、氨基酸序列分析、基因進化樹構建等分子變異研究；與GenBank中EV71毒株的各基因亞型代表株的VP1段進行同源性分析并對該株毒株定型

3、。
　　 結果：
　　 1樣本檢測結果
　　 共檢測435份手足口病臨床診斷病例的不同標本，EV71檢出率為16.78％，Cox.A16檢出率為1.38％，經(jīng)檢驗差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。檢出陽性病例中，男、女性別比為2.3:1(54/23)，但差異無統(tǒng)計學意義。對69份標本進行了細胞培養(yǎng)和病毒分離，7份標本出現(xiàn)明顯致細胞病變效應(CPE)，其中EV71占85.7％(6/7)，Cox.A16占14.3％

4、(1/7)。對分離株再次用RT-PCR檢測，陽性率達100％。
　　 2一株EV71分離株的全基因組序列分析
　　 EV71 HENAN08分離株全基因組序列長度為7405bp(未包括多聚腺苷酸尾)，其中腺嘌呤核苷酸(A)占27.01％，鳥嘌呤核苷酸(G)占24.00％，胸腺嘧啶核苷酸(T)占24.92％，胞嘧啶核苷酸(C)占24.07％。A和T豐富。從基因組的5'術端開始有742個堿基的5'非編碼區(qū)(5'UTR)，與S

5、HZH98株、BrCr株、Zhejiang08株和TW2086株(743個堿基)不同。5'UTR之后為6579bp的編碼區(qū)，編碼含2193個氨基酸的多聚蛋白，其后為84個堿基的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。與其它EV71毒株相比，HENAN08株在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入，但在5'UTR和3'UTR區(qū)存在個別核苷酸的缺失和插入。
　　 核苷酸同源性比較：在整個基因組，包括5'UTR區(qū)、編碼區(qū)(P1、P2和P3)和3'UTR區(qū)，

6、和AnhuiFY08株以及Zhejiang08株的同源性均高于95％；在P1區(qū)，HENAN08與AnhuiFY08、SHZH98、Zhejiang08、SHZH03株的同源性均>90％，與BrCr和TW2086的同源性均>80％，而與Cox.A16的同源性最低，<70％；在3'UTR區(qū)，與標準株BrCr以及TW2086的同源性最低。
　　 氨基酸同源性比較：在整個編碼區(qū)，EV71 HENAN08株與其它國內(nèi)、外EV71株的同源性

7、均較高，與Cox.A16同源性較低；在P2和P3區(qū)，HENAN08與其它國內(nèi)EV71株的同源性均較高，而與標準株BrCr以及TW2086的同源性低于Cox.A16：結構蛋白VP1區(qū)，EV71 HENAN08株與AnhuiFY08、SHZH98、標準株BrCr、Zhejiang08、SHZH03、TW2086株的同源性均>95％，與Cox.A16的同源性最低，為72.7％。結構蛋白VP4區(qū)的同源性比較都為100％。
　　 結論：<