1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文器官培養(yǎng)法保存角膜的內(nèi)皮細胞活性研究及在基因轉(zhuǎn)染和移植排斥研究中的應用姓名：魏捷申請學位級別：博士專業(yè)：眼科學指導教師：蔣華20090501第二軍醫(yī)大學博士學位論文檢測兔角膜內(nèi)皮層中Factin的表達以及TEM下CEC超微結(jié)構(gòu)的觀察。3去一t皮兔角膜片24只隨機分為4組，每組6只角膜，在添加2％FBS的ECM培養(yǎng)液中保存2～3周后與編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒載體Ad5(滴度范圍5x106vp／uL

2、“5109vp／uL)37℃下共同孵育3h進行基因轉(zhuǎn)染，隨后31℃下繼續(xù)器官培養(yǎng)觀察角膜2周。檢測前剝離大部分植片基質(zhì)，倒置熒光顯微鏡下觀察不同時間點EGFP在CEC中的表達強度，比較不同滴度組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率、CEC計數(shù)，TEM觀察CEC超微結(jié)構(gòu)變化。4選用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，新西蘭大白兔12只。將54只SD大鼠隨機分為5組：①為正常角膜組成的對照組，②為新鮮大鼠角膜同種異體穿透性移植組(penetrating

3、keratoplasty，PKP)，③為去CEC同種異體大鼠角膜器官保存兔角膜后彈力層和內(nèi)皮細胞復合體(DMcEC)移植組，④為器官培養(yǎng)法保存大鼠角膜同種異體PKP組，⑤為去CEC同基因大鼠角膜器官保存兔角膜DMCEC移植組。兔角膜保存時間2~3周不等。②～④組制備Wistar，SD大鼠PKP模型，⑤組制備SD，SD大鼠PKP模型。術后觀察各組植片的排斥情況和存活時間，酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzymelinkedimmunosorbent

4、assay，ELISA)定量檢測房水和血清中自細胞介素2(IL2)、干擾素gamma(IFN7)、白細胞介素4(IL4)和腫瘤壞死因子0【(TNFQ)的表達，IHC法定性檢測術后植片內(nèi)CD25T細胞的表達，RTPCR半定量檢測植片內(nèi)TNF0【、IFN丫、IL4和CD25mRNA的表達，流式細胞術檢測外周血中CD25和CD28亞群的表達。結(jié)果1結(jié)果顯示，ECM和ACF保存組角膜的ECD最高，細胞超微結(jié)構(gòu)與正常角膜間的區(qū)別最小，MEM組的E

5、CD值則最低，降幅最大，細胞器等超微結(jié)構(gòu)破壞較嚴重。Factin和ZO1在各組兔和大鼠角膜內(nèi)皮層都有表達。WB顯示Factin蛋白在ECM和ACF組表達水平最高，DMEM組次之，MEM組最低，RTPCR法證實ZO1mRNA在各組的表達趨勢與兔F—actin的結(jié)果一致。2保存結(jié)束時含10％HESl30／04的實驗組植片較薄，但ECD值略低于對照組。對照組經(jīng)葡聚糖T500脫水后，厚度和透明度與實驗組差別變小，但ECD值明顯降低。IHC和WB