1、支氣管哮喘(簡稱哮喘)是全球范圍內(nèi)嚴重影響公共健康的慢性疾病，其發(fā)病率和嚴重性逐年增高，但原因尚不清楚。流行病學研究認為與兒童期感染機率下降及環(huán)境中作為危險因素的污染物增多有關(guān)。其中吸煙(包括主動和被動吸煙)作為室內(nèi)空氣污染的主要來源，是哮喘發(fā)病中一個重要環(huán)境因素。國外流行病學資料顯示至少三分之一的哮喘患者經(jīng)常暴露在香煙煙霧環(huán)境中，有資料顯示發(fā)達國家至少有50％的成人哮喘患者目前吸煙或曾經(jīng)吸煙。 哮喘是多種細胞及細胞組份參與的氣

2、道慢性炎癥，隨病程延長可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑。吸煙使哮喘本來就復雜的病理生理過程進一步復雜化，吸煙不僅可以引起哮喘頻繁發(fā)作、導致哮喘患者的肺功能迅速下降，而且可以降低哮喘患者糖皮質(zhì)激素的治療效果，因此使哮喘患者病情不易控制。吸煙對哮喘發(fā)生發(fā)展及臨床表現(xiàn)的影響是復雜的，相關(guān)的研究報道很少，具體機制尚不清楚。 研究表明吸煙和許多疾病如社區(qū)獲得的肺炎，肺癌及呼吸道感染密切相關(guān)，因此認為可能與吸煙改變宿主的免疫反應有關(guān)。香煙煙

3、霧中的主要成分之一尼古丁，具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠影響免疫監(jiān)視功能，并促進疾病的發(fā)生發(fā)展。 輔助性T細胞1(Th1)/輔助性T細胞2(Th2)失衡是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，無論氣道炎癥還是氣道重塑都受到Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)。輔助性T細胞(CD4+T細胞)，即Th細胞，可分為Th1和Th2兩個亞群，Th1細胞主要分泌細胞因子γ干擾素(IFN—γ)、白細胞介素(IL)-2、IL-12等，可激活巨噬細胞，在抗病毒感染和胞內(nèi)細菌感染的免疫

4、應答中發(fā)揮作用。Th2細胞主要分泌細胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，參與急性超敏反應，對B細胞合成所有抗體包括IgE有輔助作用，在對過敏原和寄生蟲感染的免疫反應中起作用。T—bet/GATA-3是近年來新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，分別是誘導Th1/Th2極性分化以及分泌相應效應性細胞因子的專有性轉(zhuǎn)錄因子。研究認為T—bet/GATA-3表達變化可間接反映體內(nèi)Th1/Th2類細胞數(shù)量以及Th1/Th2類細胞因子表達水平

5、的動態(tài)變化。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcell，Treg)是一類獨特的CD4+T細胞，在抑制主動免疫及維持免疫耐受中起著關(guān)鍵性作用；叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)在一定程度上可以反映CD4+CD25+Treg的水平和功能活性；新近研究認為，Treg可明顯抑制Th1、Th2活化增殖，是在Th1/Th2網(wǎng)絡平衡之上的更高層次

6、調(diào)控者，并可能在控制支氣管哮喘和過敏性疾病的發(fā)病中起重要作用。 吸煙對調(diào)控Th1/Th2平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T—bet、GATA-3的影響未見文獻報道，吸煙對Treg的數(shù)量及Foxp3表達影響的研究報道鮮見。轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，在哮喘等氣道炎癥性疾病的發(fā)病機制中成為研究熱點，有望成為新的治療靶點。鑒于上述研究背景和研究現(xiàn)狀，本實驗將通過體內(nèi)、體外實驗，從不同細胞水平研究吸煙及主要成份尼古丁對哮喘Th1/

7、Th2免疫平衡的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制，一方面深入探討吸煙加重哮喘的免疫學機制，另一方面也為哮喘治療探尋新的靶點。 研究內(nèi)容: 1．香煙煙霧暴露對哮喘大鼠Th1/Th2細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達的影響； 2．香煙煙霧提取物對卵蛋白致敏大鼠脾淋巴細胞Th1/Th2細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達的影響； 3．尼古丁對卵蛋白致敏CD4+T淋巴細胞Th1/Th2細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子

8、T—bet/GATA-3表達的影響； 4．香煙煙霧暴露對哮喘大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達的影響。 研究方法: 實驗一：香煙煙霧暴露對哮喘大鼠Th1/Th2細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達的影響。 1．復制動物模型：雄性Wistar大鼠，隨機分為4組：對照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘組+煙霧暴露組，每組10只。建立慢性哮喘大鼠模型(1％OVA霧化激發(fā)8周，1次

9、/天，5天/周)和慢性哮喘大鼠吸煙模型(吸煙和OVA霧化激發(fā)同時開始，1次/天，5天/周，共8周)。 2．HE染色觀察各組大鼠氣道炎性細胞浸潤及支氣管壁厚度變化。 3．Masson染色觀察各組氣道膠原含量。 4．ELISA法測定肺組織和血漿IFN—γ/IL-4含量。 5．Westernblot法檢測肺組織T—bet/GATA-3蛋白表達。 6．QuantitiverealtimeRT-PCR檢測肺

10、組織T—bet/GATA-3mRNA表達。 實驗二：香煙煙霧提取物對卵蛋白致敏大鼠脾淋巴細胞Th1/Th2細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA-3表達的影響。 1．大鼠OVA致敏和脾淋巴細胞的分離：6-8周齡雄性Wistar大鼠，第1天、8天分別腹腔內(nèi)注射OVA和氫氧化鋁混合液致敏，第15天麻醉動物無菌取脾，分離脾淋巴細胞。 2．不同濃度香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)的干預

11、：將脾淋巴細胞隨機分為4組：對照組、0.5％CSE組、1％CSE組、2％CSE組，同時各孔均加入OVA作為特異性刺激物，CSE作用24小時。 3．ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IFN—γ/IL-4含量。 4．QuantitativerealtimeRT-PCR檢測培養(yǎng)細胞T—bet/GATA-3mRNA的表達。 實驗三：尼古丁對OVA致敏大鼠CD4+T細胞Th1/Th2細胞因子和T—bet/GATA-3表達的影響

12、。 1．大鼠OVA致敏：方法同實驗二。 2．CD4+T細胞的分離及不同濃度尼古丁的干預：大鼠CD4+T純化柱分離CD4+T細胞，將CD4+T細胞隨機分為4組：對照、1μg/ml尼古丁組、10μg/ml尼古丁組、100μg/ml尼古丁組，同時各孔均加入OVA作為特異性刺激物，尼古丁刺激24小時。 3．ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-4和IFN—γ含量。 4．QuantitiverealtimeRT-PC

13、R檢測培養(yǎng)細胞T—bet/GATA-3mRNA的表達。 實驗四：香煙煙霧暴露對哮喘大鼠CD4+CD25+T細胞數(shù)量及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達的影響。 1．復制動物模型：同實驗一。 2．流式細胞儀檢測大鼠外周血CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞的比例。 3．Westernblot法檢測肺組織Foxp3蛋白的表達。 研究結(jié)論: 1．香煙煙霧暴露可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子T—bet/GATA

14、-3表達，進而加重哮喘大鼠Th1/Th2失衡，在哮喘的氣道炎癥及氣道重塑中扮演重要角色。 2．尼古丁在吸煙加重哮喘的Th1/Th2失衡中起重要作用。 3.2個月卵蛋白霧化激發(fā)哮喘模型中CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞的比例下調(diào)，F(xiàn)oxp3蛋白表達下降，二者可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。 4．香煙煙霧暴露降低轉(zhuǎn)錄因子的Foxp3蛋白表達及下調(diào)CD4+CD25+Treg細胞比例，可能為吸煙加重哮喘Th1/T