1、目的:骨髓源性肝干細胞(bone marrow-derived liver stem cell,BDLSC)來源充足,增殖能力強,在體內(nèi)外均有極強的向肝系細胞分化的能力,成為基因治療肝臟疾病理想的靶細胞。尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator,uPA)在降解纖維、逆轉(zhuǎn)肝纖維化中起重要作用。本研究將攜帶人uPA基因的腺病毒(adenovirus carryinghuman uPA

2、cDNA,AduPA)體外轉(zhuǎn)染BDLSC,移植入肝纖維化大鼠體內(nèi),評價轉(zhuǎn)基因BDLSC對肝纖維化的治療效果,從而為其臨床應用治療肝纖維化提供理論依據(jù)和實踐基礎。
　　 方法:利用淤膽型肝損傷大鼠模型和含5％淤膽血清的培養(yǎng)液篩選和擴增BDLSC,檢測BDLSC肝干細胞標志表達和功能。體外將AduPA轉(zhuǎn)染BDLSC,檢測其對BDLSC增殖和分化的影響。將轉(zhuǎn)基因BDLSC移植入四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl

3、4)誘導的肝纖維化大鼠體內(nèi),通過檢測肝功能、膠原面積、肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化指標、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與降解指標、肝細胞增殖等指標,評價其對大鼠肝纖維化的影響。
　　 結果:培養(yǎng)2周的骨髓細胞形成肝細胞樣集落,表達肝干細胞標志白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)和細胞角蛋白18(cytokera

4、tin18,CK18),并具有尿素合成和糖原貯備能力。當感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為500時,AduPA轉(zhuǎn)染BDLSC陽性細胞數(shù)72 h表達最強達92.6±2.2％,且轉(zhuǎn)染AduPA對BDLSC增殖和分化無明顯影響。體內(nèi)研究顯示,與模型組和BDLSC組相比,BDLSC-uPA組大鼠肝組織纖維面積明顯減少,肝功能明顯改善,α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA

5、)、轉(zhuǎn)化生長因子-B1(transforming growthfactor-B1,TGF-B1)蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原(collagenⅠ、Ⅲ,CⅠ、Ⅲ、)mRNA表達顯著下降,基質(zhì)金屬蛋白酶-2、3、9(matrix metalloproteillases-2、3、9,MMP-2、3、9)、肝細胞生長因子(hepatic growth factor,HGF)mRNA和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear a

6、ntigen,PCNA)蛋白表達明顯上調(diào),金屬蛋白酶組織抑制物-1、2(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1、2,TIMP-1、2)和Smad3、7 mRNA表達無明顯變化。
　　 結論:分離肝損傷大鼠骨髓干細胞,經(jīng)體外淤膽血清篩選、分化和擴增,可快速、高效地獲得BDLSC。體外利用AduPA轉(zhuǎn)染BDLSC,uPA基因可在BDLSC中穩(wěn)定表達,且對BDLSC的增殖和分化無明顯影響。uPA基