1、目的: 應(yīng)用組織芯片結(jié)合原位雜交的方法篩選出HA117基因組織表達(dá)譜。然后以組織表達(dá)譜篩選出的高表達(dá)HA117基因的腎臟組織為模板，通過(guò)RACE的方法克隆基因全長(zhǎng)cDNA，進(jìn)一步應(yīng)用重組腺病毒介導(dǎo)的方法獲得高表達(dá)HA117基因的K562、Jurkat細(xì)胞，初步研究HA117基因?qū)562、Jurkat細(xì)胞的多藥耐藥（MDR）功能。 方法: 1.組織表達(dá)譜篩選，選取石蠟包埋的31例常見(jiàn)腫瘤組織標(biāo)本制和17例癌旁正常

2、組織制作組織芯片，應(yīng)用mRNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)HA117mRNA在組織芯片各種組織中的表達(dá)情況； 2.組織表達(dá)譜結(jié)果提示腎臟組織高表達(dá)HA117基因，收集并提取腎臟組織總mRNA，首先應(yīng)用RT-PCR方法驗(yàn)證HA117基因在腎臟組織表達(dá)情況；然后在高表達(dá)HA117基因腎臟組織中，根據(jù)已獲得的已知HA117基因序列為模板設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RACE技術(shù)克隆HA117基因全長(zhǎng)cDNA序列； 3.構(gòu)建攜帶新基因HA117全長(zhǎng)cD

3、NA序列的重組腺病毒，酶切質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV和目的基因HA117后，用T4DNA連接酶將載體和目的基因定向克隆連接，然后篩選和鑒定含目的基因HA117的重組質(zhì)粒pAdTrack-HA117。將篩選正確的質(zhì)粒pAdTrack-HA117導(dǎo)入已制備的腺病毒同源骨架質(zhì)粒BJ-Adeasy中，產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒Adeasy-HA117，進(jìn)一步酶切鑒定得到的重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-HA117。脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將Adeasy-HA11

4、7轉(zhuǎn)染入產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞HEK293，通過(guò)乒乓感染，收獲高滴度Ad5-HA117重組腺病毒；并用RT-PCR方法驗(yàn)證，HA117基因在重組腺并毒Ad5-HA117感染的HEK293細(xì)胞的表達(dá)情況； 4.重組腺病毒Ad5-HA117體外感染K562、Jurkat細(xì)胞，將重組腺病毒Ad5-HA117體外感染K562、Jurkat細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR方法檢測(cè)感染后的K562細(xì)胞HA117表達(dá)情況； 5.檢測(cè)感染重組

5、腺病毒Ad5-HA117使HA117基因高表達(dá)后白血病細(xì)胞耐藥性改變：實(shí)驗(yàn)分四組：K562細(xì)胞組，K562/Ad5-HA117細(xì)胞組，K562/ Ad5-GFP細(xì)胞組，K562/ Ad5-mdrl細(xì)胞組，Jurkat細(xì)胞分組同K562。通過(guò)對(duì)細(xì)胞活性、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT法抗癌藥物敏感實(shí)驗(yàn)，柔紅霉素排泄實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)HA117基因高表達(dá)前后細(xì)胞形態(tài)及耐藥性的變化，初步研究HA117基因的耐藥功能及耐藥機(jī)制。 結(jié)果: 1.新基因

6、HA117 mRNA在人體癌旁正常組織和良性腫瘤、惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，惡性腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率高于良性腫瘤及癌旁正常組織中表達(dá)陽(yáng)性率（P>0.5）。在鱗癌和腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是16.67％和61.54％，腺癌中的表達(dá)高于鱗癌（P<0.05）。有轉(zhuǎn)移的癌組織中HA117 mRNA的表達(dá)率高達(dá)70％，明顯高于非轉(zhuǎn)移型腫瘤組織的20％（P<0.05）； 2.首先采用RT-PCR方法驗(yàn)證了HA117基因在腎臟組織中高表達(dá)。HA1

7、17基因的3'RACE PCR產(chǎn)物大小在400bp左右，5'以RACE PCR產(chǎn)物大小在950bp左右，將HA117基因3'RACE序列、5'RACE擴(kuò)增序列與已知的HA117基因序列拼接后，得到1110 bp的全長(zhǎng)cDNA序列； 3.經(jīng)酶切鑒定成功構(gòu)建腺病毒重組質(zhì)粒Ad5-HA117，重組腺病毒Ad5-HA117成功轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)得到良好的表達(dá)，并在包裝細(xì)胞中迅速擴(kuò)增，獲得高滴度的重組腺病毒。收獲的病毒感染液滴度達(dá)1.

8、5×1011pfu/ml；RT-PCR方法證實(shí)外源性HA117基因在感染HEK293細(xì)胞基因組中功能性表達(dá)； 4.重組腺病毒Ad5-HA117成功將外源性HA117基因?qū)隟562、Jurkat細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)隨著感染復(fù)數(shù)的增加，病毒對(duì)K562、Jurkat細(xì)胞的感染率也增加，MOI值為100時(shí)細(xì)胞的存活率和感染率均較好，轉(zhuǎn)染率分別可以達(dá)到39.72％、17.10％；RT-PCR方法證實(shí)外源性HA117基因在轉(zhuǎn)染K562

9、、Jurkat細(xì)胞基因組中功能性表達(dá)； 5.轉(zhuǎn)染HA117基因的K562、Jurkat細(xì)胞對(duì)VCR、AD5M、Vp-16、DNR、MMC、CTX藥物的耐藥性均比低表達(dá)HA117基因未轉(zhuǎn)染的k562、Jurkat細(xì)胞增高，分別增高2～7倍（P<0.05或0.01），轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞耐藥性跟未轉(zhuǎn)染組的k562、Jurkat細(xì)胞相比無(wú)顯著差異（P>0.05）；感染Ad5-HA117組細(xì)胞與感染Ad5-mdrl組相比，耐藥性無(wú)顯著差異（

10、P>0.05）。轉(zhuǎn)染HA117基因的使其高表達(dá)后的K562、Jurkat細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染了MDR1基因的細(xì)胞組柔紅霉素排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染Ad5-HA117組細(xì)胞未見(jiàn)有明顯的藥物外排泵功能。 結(jié)論: 1.初步證實(shí)HA117基因，在人體癌旁正常組織和良性腫瘤、惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，惡性腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率高于良性腫瘤及癌旁正常組織中表達(dá)陽(yáng)性率。HA117表達(dá)陽(yáng)性率可能與惡性腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型及是否為轉(zhuǎn)移瘤有關(guān)； 2.

11、腎臟組織中高表達(dá)HA117基因，采用RACE法從腎臟組織中成功克隆得到了HA117基因全長(zhǎng)cDNA序列，為全長(zhǎng)1110bp； 3.應(yīng)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了HA117重組腺病毒Ad5-HA117。通過(guò)熒光顯微鏡證實(shí)，重組腺病毒Ad5-HA117成功轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)得到良好的表達(dá)，獲得高滴度的重組腺病毒。證實(shí)外源性HA117基因在感染的HEK293細(xì)胞有效表達(dá)； 4.通過(guò)腺病毒載體可在體外將外源性HA117基因有效的轉(zhuǎn)