1、該研究探討了偽狂犬病毒最主要的保護性抗原基因gC基因"自殺性"DNA疫苗的免疫原性和保護效力;研究了偽狂犬病毒VP22的蛋白轉導特性;比較了4種VP22的蛋白轉導特性及其增強DNA疫苗免疫反應的差異并篩選了增強效果最好的VP22;評價了所篩選的VP22增強不同分子量大小的模式抗原以及PrV gC基因"自殺性"DNA疫苗免疫反應的能力.主要研究內(nèi)容如下:1.PrV Ea株gC基因的克隆與序列分析.從PrV Ea株基因組DNA中通過酶切和S

2、outhern雜交克隆了完整的gC基因進行了序列測定、糖基化位點和抗原表位預測、進化系統(tǒng)分析與序列比較.2.gC基因在大腸桿菌中的高效表達與gC-ELISA方法的建立.以pET-28a為載體,構建了gC基因的原核表達pETC1.5,經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效表達,表達蛋白的分子量約為62kDa,主要以包涵體形式存在,Western blot檢測證實具有良好的反應原性.3.偽狂犬病毒gC基因"自殺性"DNA疫苗的

3、免疫保護.分別以pcDNA3.1+和pSFV-DNA為載體,構建了gC基因的常規(guī)DNA疫苗表達質粒pcDC和"自殺性"DNA疫苗表達質粒pSFVC1.5,轉染BHK-21細胞,Western blot檢測證實兩種表達質粒均能正確表達gC,而且pSFVC1.5還能誘導轉染細胞發(fā)生細胞凋亡.4.偽狂犬病毒VP22蛋白轉導特性.構建了PrV VP22(PVP22)與綠熒光蛋白突變體mut4EGFP融合的真核表達質粒pcPM4,轉染Hela細胞

4、并與mut4EGFP非融合表達質粒(pcM4)進行比較,發(fā)現(xiàn)PVP22-mut4EGFP融合蛋白的熒光呈多種分布,但主要以顆粒的形式分布在核或核外周,也有部分細胞的熒光呈胞漿分布,而pcM4轉染細胞的熒光全部呈彌漫型,分布于整個細胞.5.與PVP2融合增強mut4EGFP DNA疫苗的體液免疫和細胞免疫.以pTWIN1為載體,在大腸桿菌中高效表達了mut4EGFP.采用幾丁質親和層析,獲得了高純度的重組mut4EGFP蛋白,可作為ELI

5、SA檢測抗原.將表達PVP22-mut4EGFP融合蛋白的質粒pcPM4免疫小鼠,并與mut4EGFP非融合表達質粒pcM4進行比較,發(fā)現(xiàn)與PVP22融合表達能顯著增強mut4EGFP特異性ELISA抗體和CTL活性,而PVP22和mut4EGFP兩種非融合表達質粒的聯(lián)合免疫不能增強免疫反應,表明免疫反應的增強是PVP22蛋白轉導作用的結果.6.比較4種VP22增強DNA疫苗的體液免疫和細胞免疫.比較了PrV、BHV-1、HSV-1和M

6、DV-14種VP22的氨基酸同源性,發(fā)現(xiàn)4種VP22近C末端長約80個氨基酸,即:PVP22的149-231AA、BVP22的146-228AA、HVP22的174-256AA、MVP22的92-174AA,呈現(xiàn)高度的同源性,推測是VP22潛在的蛋白轉導結構域;預測了4種VP22的空間結構.7.BVP22增強模式抗原"自殺性"DNA疫苗的體液免疫和細胞免疫.構建了與BVP22融合的mut4EGFP自殺性"DNA疫苗pSCAM4,體外檢測