1、油酰磷脂酰膽堿去飽和酶(FAD2)是一種重要的植物脂肪酸去飽和酶，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，催化油酸生成亞油酸。亞油酸等多不飽和脂肪酸含量過(guò)高的植物油脂不穩(wěn)定，易氧化，不易貯藏，而且氧化產(chǎn)物對(duì)人體有害。因此油脂改良的一個(gè)重要目的是提高種子油脂的油酸含量，降低多不飽和脂肪酸含量。另外，關(guān)于FAD2的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控等問(wèn)題目前還不清楚，有待深入研究。近年發(fā)展起來(lái)的RNAi技術(shù)可有效地沉默目標(biāo)基因，研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的變化及溫度對(duì)基

2、因沉默的影響，有助于深入理解FAD2酶的功能、表達(dá)調(diào)控方式和有效地利用基因沉默技術(shù)改變膜脂組成、提高植物油脂品質(zhì)。本研究的主要目的是，首先采用RNAi技術(shù)抑制煙草FAD2基因(NtFAD2)的表達(dá)以降低NtFAD2酶活性，得到膜脂不飽和度改變的煙草轉(zhuǎn)基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去飽和過(guò)程的變化及其機(jī)理，以及溫度對(duì)NtFAD2基因沉默的影響。研究中首先用PCR方法克隆煙草NtFAD2基因，用其編碼區(qū)的一個(gè)片段構(gòu)建表達(dá)發(fā)卡

3、RNA的沉默結(jié)構(gòu)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草，從第一代轉(zhuǎn)基因植株中篩選出油酸含量高的突變體。然后對(duì)其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系S61進(jìn)行脂肪酸分析，發(fā)現(xiàn)葉片總脂和質(zhì)體外單脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外，NtFAD2基因沉默對(duì)葉片甘油脂的影響有多效性，即質(zhì)體內(nèi)的單脂油酸含量也有顯著增加，有些單脂中軟脂酸含量有所下降。煙草NtFAD2基因沉默后，在葉片和種子中油酸含量變化最大，說(shuō)明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同：沉默結(jié)構(gòu)對(duì)NtF

4、AD2酶活性較高的器官抑制程度更大，內(nèi)源基因沒(méi)有表現(xiàn)均一的沉默效果。沉默植株的多種組織中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似，說(shuō)明油酸含量與NtFAD2轉(zhuǎn)錄本的豐度沒(méi)有直接關(guān)系。
　　 植物脂肪酸的不飽和程度受溫度調(diào)控，因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受溫度影響情況及其調(diào)控規(guī)律對(duì)RNAi技術(shù)在油脂改良方面的實(shí)際應(yīng)用具有十分重要的意義。研究結(jié)果表明，隨著生長(zhǎng)溫度的下降，野生煙草葉片膜脂油酸含量降低，多不飽和脂肪酸含量隨之增

5、加；轉(zhuǎn)基因煙草中油酸和多不飽和脂肪酸有相似的變化趨勢(shì)，但是變化幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生煙草。低溫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片油酸含量之所以大幅度下降，其中一個(gè)重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低溫的調(diào)節(jié)而活性升高。然而研究發(fā)現(xiàn)，與常溫條件下相比，低溫下轉(zhuǎn)基因煙草NtFAD2基因的mRNA豐度不變，說(shuō)明低溫沒(méi)有影響沉默結(jié)構(gòu)對(duì)NtFAD2基因的mRNA的降解。低溫環(huán)境下NtFAD2基因沉默植株的多不飽和脂肪酸含量有所回升可能是植物對(duì)低溫的一種適應(yīng)性響應(yīng)。轉(zhuǎn)基因