1、HER2(Her2/neu])原癌基因是人類表皮生長因子受體2(Human EpidermalGrowth Factor Receptor-type 2)的編碼基因，所編碼的蛋白為185kDa，并具有酪氨酸激酶活性。HER2在人類乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、胃癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中存在擴增及過量表達，并與腫瘤的侵襲性表型及生存期短密切相關(guān)。HER2癌基因的致癌機制包括：抑制凋亡，促進存活；促進腫瘤新生血管生成；增加腫瘤細胞的侵襲力等。

2、HER2在20-25﹪的浸潤性乳腺癌中存在過表達，并具有以下特點： (1)HER2水平與乳腺癌的發(fā)病及預(yù)后具有很強的相關(guān)性； (2)HER2在人類癌細胞中的基因擴增水平遠遠高于正常組織；(3)HER2在腫瘤細胞中以很高的比例存在，高表達HER2的腫瘤通常顯示均一的、強烈的免疫組化染色； (4)HER2過表達不僅見于腫瘤原發(fā)灶，在轉(zhuǎn)移灶中也有過表達。上述特點提示，抗HER2治療會以大多數(shù)的腫瘤細胞為靶點，而對正常組織的毒性較低，并可能對所

3、有部位的腫瘤都有效。因而HER2在乳腺癌中已成為重要的治療靶點。 目前抗HER2治療的策略有： (1)以HER2蛋白為靶點的治療，包括外源性阻斷抗體、干擾受體異二聚體化抗體、抗HER2疫苗、酪氨酸激酶抑制劑、細胞內(nèi)單鏈抗體等，其中曲妥珠單抗(Trastuzumab，Herceptin)是已進入臨床應(yīng)用的人源化單克隆抗體，與化療聯(lián)合能增加有效率、延長疾病進展時間及生存期。(2)以HER2基因為靶點的治療，包括HER2基因啟動子轉(zhuǎn)錄

4、抑制劑、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)、核酶技術(shù)、反義RNA技術(shù)等。每種策略各有其優(yōu)缺點。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。利用RNAi技術(shù)可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默，這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默

5、機制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)最終抑制蛋白表達。dsRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的是21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)。由于RNAi對染色體DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響，具有高度的序列特異性和抑制基因表達的高效性，而且RNAi的效應(yīng)可以在不同細胞間長距離傳遞和維持，或在某些生物中具有遺傳性，所以迅速成為一種

6、功能強大的研究哺乳動物中選擇性抑制特異性基因表達和研究基因功能的工具。 本研究目的：探討RNAi技術(shù)沉默HER2基因的效果，以及HER2基因沉默對腫瘤細胞Taxol敏感性、Survivin、VEGF基因表達的影響。研究內(nèi)容分兩部分： 1．siRNA表達質(zhì)粒沉默HER2基因及其效果：GenBank查找HER2基因的mRNA序列(GenBank ID：NC-000017)，根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，設(shè)計出3個針對HER2進行

7、干擾作用的靶點，進行Blast基因同源性分析以保證基因沉默的特異性，RNA Draw軟件分析mRNA二級空間結(jié)構(gòu)。靶序列1(基因序列23194-23214)： 5'-TCTCTGCGGTGGTTGGCATTC-3’，命名為H1；靶序列2(基因序列6945-6966)：5'-GGGAAACCTGGAACTCACCTAC-3’，命名為H2；靶序列3(基因序列27229-27251)：5'-AAGGGGCTGGCTCCGATGTATTT-3’

8、，命名為H3；無義對照目標基因序列：5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’，命名為CON。人工合成各單鏈DNA片段，退火形成發(fā)夾狀siRNADNA雙鏈，插入到pGenesil-1 vector U6的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之間。重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選kana抗性克隆，提取質(zhì)粒，分別對構(gòu)建的表達載體pGenesil-1質(zhì)粒(H1、H2、H3和CON)進行測序，經(jīng)測序鑒定，確認得到的序列為所需序列。采用METAFE

9、CTENE轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HER2高表達乳腺癌細胞株SK-BR-3及卵巢癌細胞株SK-OV-3，轉(zhuǎn)染后72小時，實驗細胞加入G418終濃度為250μg/ml的完全RPMI-1640培養(yǎng)液。篩選3周后大部分細胞死亡，存活的細胞為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒穩(wěn)定表達的細胞。細胞篩選出來后，采用RT-PCR和Western Blot法觀察HER2基因的沉默效果；CCK-8比色分析檢測細胞體外增殖活力及對Taxol的敏感性；流式細胞儀檢測細胞周期。 HER2特異性si

10、RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SK-BR-3細胞后，SK-BR-3細胞形態(tài)學上表現(xiàn)為皺縮、變圓、脫落；篩選出的陽性克隆生長非常慢，難以形成單層貼壁狀態(tài)，表明3個特異性HER2 siRNA對SK-BR-3細胞均有顯著的生長抑制作用。但因細胞生長緩慢，未能擴大培養(yǎng)進行進一步檢測。 HER2特異性siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SK-OV-3細胞后，細胞形態(tài)與親本細胞相似，但生長速度較緩慢。RT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了特異性HER2s

11、iRNA的細胞HER2 mRNA及p185蛋白水平均明顯低于親本細胞及轉(zhuǎn)染無義對照序列的細胞；CCK-8比色分析顯示HER2基因沉默的細胞存活分數(shù)明顯低于HER2基因高表達的細胞(P=0.000)；流式細胞儀細胞周期分析也顯示，HER2基因沉默的細胞處于凋亡狀態(tài)及非增殖期的比例明顯增加(P均<0.01)，而處于合成期的比例卻顯著減少(P<0.001)，細胞周期主要阻滯于G0/G1期。HER2基因沉默的SK-OV-3細胞Taxol劑量反應(yīng)

12、曲線右移，IC50值也明顯升高，對Taxol的敏感性下降。 2．HER2基因沉默對Survivin、VEGF基因表達的影響：采用RT-PCR和WesternBlot法檢測轉(zhuǎn)染了特異性HER2 siRNA的SK-OV-3細胞Survivin與VEGF mRNA及相應(yīng)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示HER2基因沉默的SK-oV-3細胞Survivin與VEGF mRNA及相應(yīng)蛋白的表達均明顯受抑制。 結(jié)論： 1．HER2特

13、異性siRNA表達質(zhì)粒對SK-BR-3細胞具有顯著的生長抑制作用。 2．HER2特異性$iRNA表達質(zhì)粒能夠從mRNA及蛋白水平穩(wěn)定、持久地沉默SK-OV-3細胞的HER2基因。 3．HER2基因沉默可使SK-OV-3細胞增殖減慢，凋亡率增加，細胞周期阻滯于G0/G1期。 4．HER2基因沉默可使SK-OV-3細胞對Taxol的敏感性下降。以HER2基因為靶點的RNAi治療與raxol化療聯(lián)合治療卵巢癌需慎重。