1、目的:探討針對(duì)STAT5A基因的siRNA表達(dá)載體對(duì)人肝癌細(xì)胞系 HepG2細(xì)胞中STAT5A基因表達(dá)的特異性抑制作用及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響,為干擾STAT5基因作為腫瘤基因治療新策略的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:設(shè)計(jì)2條針對(duì)STAT5A基因的RNA干擾靶序列GCTCTGAATTAGTCCTTGCTT和 GCGCTTTAGTGACTCAGAAAT,合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸,退火形成雙鏈 DNA。將 pYr-2.1表達(dá)載體經(jīng)Bs

2、aI酶切后電泳分離,純化回收大片段。將退火形成的雙鏈DNA通過(guò)T4 DNA連接酶連接到線性化 pYr-2.1質(zhì)粒U6啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-1和 pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)Kanar抗性和CCDB致死基因篩選,挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增,并抽提純化質(zhì)粒,然后將抽提的重組質(zhì)粒進(jìn)行XhoI單酶切和瓊脂糖電泳分析,同時(shí)做測(cè)序

3、鑒定以確定插入的干擾片段準(zhǔn)確無(wú)誤,即針對(duì)STAT5A基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。同法構(gòu)建不針對(duì)任何基因的shRNA陰性對(duì)照 pYr-2.1-HK。培養(yǎng) HepG2細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板中,并設(shè)置空白細(xì)胞對(duì)照組、HK陰性對(duì)照組、STAT5A-1干擾組、STAT5A-2干擾組。用表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的 pYr-2.1-EGFP以檢測(cè)肝癌細(xì)胞 HepG2的轉(zhuǎn)染效率,以每孔脂質(zhì)體7.5

4、μl、重組質(zhì)粒3μg配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,加入各孔 HepG2細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(空白組不加任何試劑),轉(zhuǎn)染后48h質(zhì)粒pYr-2.1-EGPF上帶有的EGFP基因得以表達(dá),熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞所占比例,以此來(lái)判斷轉(zhuǎn)染效率。接著用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA,并應(yīng)用核酸定量分析儀及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA樣本的濃度、純度以及完整性。以各組總RNA為模板,GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行兩步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

5、反應(yīng)(RT-PCR),瓊脂糖凝膠電泳分析,并用灰度半定量檢測(cè)各組STAT5A mRNA的相對(duì)表達(dá)量；另在轉(zhuǎn)染后72h進(jìn)行FITC/PI雙染每組細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:①重組質(zhì)粒 pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA—1和pYr-2.1-hU6-STAT5A-shRNA-2經(jīng)XhoI酶切鑒定和測(cè)序鑒定證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。②以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞

6、后48h熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染效率約為65％以上。③RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示:各組泳道中內(nèi)對(duì)照GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(410bp)的亮度相似,而STAT5A-1干擾組、STAT5A-2干擾組擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(452bp)的亮度均明顯弱于其它二組?；叶葤呙璋攵拷Y(jié)果顯示,空白細(xì)胞對(duì)照組、HK對(duì)照組、STAT5A-1干擾組、STAT5A-2干擾組HepG2細(xì)胞中 STAT5A mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.038±0.013、1.0

7、53±0.016、0.353±0.014、0.450±0.012。經(jīng)q檢驗(yàn)方差分析,STAT5A—1干擾組、STAT5A-2干擾組STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別與空白組、陰性對(duì)照組相比,分別下降66.0％和56.64％左右,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而空白細(xì)胞對(duì)照組與HK組之間相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。④通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率百分顯示:STAT5A-1干擾組、STAT5A-2干擾組細(xì)胞凋亡顯著,凋亡率分別為3