1、1.研究背景
　　當(dāng)下癌癥已經(jīng)成為人類致死的重要因素之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的身心健康。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)腫瘤發(fā)病率高且有逐年上升的趨向。目前，藥物化療、放療和手術(shù)治療是臨床上治療腫瘤的主要手段，即便它們?cè)谥委煱┌Y過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但是在藥物治療腫瘤過(guò)程中容易出現(xiàn)耐藥性，毒副作用等不良反應(yīng)，而且制藥成本也逐漸增高，因此探求新型的特異性抗腫瘤藥物的任務(wù)顯得尤為迫切。近來(lái)年傳統(tǒng)中藥越來(lái)越受到人們的關(guān)注，因其毒副作用小，價(jià)格

2、低廉，來(lái)源廣泛，種類繁多等優(yōu)勢(shì)。冬凌草甲素是從唇形科植物中分離提取的一種無(wú)色棱柱狀結(jié)晶，無(wú)色，味苦，不溶于水的貝殼杉烯二萜類天然化合物。冬凌草甲素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如胰腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。盡管目前人們對(duì)冬凌草甲素抗癌作用及其抗癌作用機(jī)制研究展開(kāi)了大量的研究，但其作用于腫瘤細(xì)胞的信號(hào)路徑及其特點(diǎn)仍有許多未解之處，不能有效安全的為臨床用藥提供指導(dǎo)。本文運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步揭示冬凌草甲素作用于腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，

3、進(jìn)一步為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　2.研究目的
　　研究冬凌草甲素誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)信號(hào)通路
　　3.研究方法
　　3.1.冬凌草甲素濃度從低到高作用于HepG2肝癌細(xì)胞24h后，MTT法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)該腫瘤細(xì)胞的抑制率及其生長(zhǎng)曲線；結(jié)晶紫法觀察藥物作用細(xì)胞數(shù)量的變化
　　3.2.不同濃度冬凌草甲素作用HepG2肝癌細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

4、；
　　3.3.Western blotting檢測(cè)不同藥物濃度的冬凌草甲素作用于HepG2后ATR和P-ATR、ATM和P-ATM、CHK1和P-CHK1、Cdk1和P-Cdk1、、H2AX和γ-H2AX、CDC25C和P-CDC25C等與細(xì)胞周期引起凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響。
　　4.結(jié)果
　　4.1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：低濃度冬凌草甲素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用較弱，高濃度冬凌草甲素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用

5、較強(qiáng)，抑制率呈劑量依賴性；結(jié)晶紫法顯示：冬凌草甲素藥物濃度越高，結(jié)晶紫染色越少，細(xì)胞存活率越低，存活細(xì)胞數(shù)量越少。
　　4.2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：冬凌草甲素阻滯HepG2肝癌細(xì)胞于G2/M期，冬凌草甲素藥物濃度越高，HepG2肝癌細(xì)胞處于G2/M期的數(shù)量越多。
　　4.3.Western blotting檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞相關(guān)蛋白顯示：不同濃度的冬凌草甲素作用HepG2肝癌細(xì)胞24h后，其Weste

6、rn印跡結(jié)果表明，隨著藥物濃度增加，P-ATM、P-ATR、γ-H2AX、P53、Phos-P53、P-CDC25C、P-Cdk1、P-CHK1、P-CHK2蛋白在細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)增加，CDC25C，Cdk1蛋白表達(dá)逐漸減少，CyclinB1蛋白表達(dá)則無(wú)差別。
　　5.結(jié)論
　　冬凌草甲素可明顯抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖，其細(xì)胞IC50為：（31.92±1.8）μmol/L；冬凌草甲素在抑制HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，與細(xì)胞周