1、胚胎性別鑒定是胚胎工程技術(shù)的重要部分之一,對家畜育種、生產(chǎn)和遺傳疾病的防治均有非常重要的意義.該論文為建立一種快速、可靠、易操作的牛胚胎性別鑒定方法做了以下探討:1、選用牛Y染色體特異序列設(shè)計引物建立PCR牛胚胎性別鑒定擴增體系.分別選擇BOV97M做公牛特異擴增引物及1.715衛(wèi)星DNA做牛特異擴增內(nèi)標引物.在連續(xù)多重PCR里,前11個循環(huán)只用雄性特異引物擴增,之后再加入內(nèi)標引物繼續(xù)進行25個循環(huán)的擴增.BOV97M引物擴增產(chǎn)物為14

2、1bp,牛衛(wèi)星1.715DNA擴增產(chǎn)物為216bp.用牛血樣DNA優(yōu)化連續(xù)多重PCR體系,該體系的準確率和靈敏度分別為100％(66/66)、10pg?；蚪MDNA(約3個細胞).由于在擴增過程中暫停循環(huán)添加內(nèi)標引物,不僅費時費力,而且容易污染,故該擴增體系不適宜做為現(xiàn)場牛胚胎性別鑒定試劑盒.2、選用牛牙釉蛋白(bAML)序列設(shè)計一對引物建立PCR牛胚胎性別鑒定擴增體系.該PCR體系對母牛DNA擴增只有一種產(chǎn)物(467bp),而對公牛D

3、NA的擴增有兩種大小不同的產(chǎn)物(467bp,341bp).該實驗從鎂離子濃度、退火溫度、酶濃度、引物濃度、變性劑、循環(huán)數(shù)及反應(yīng)體積等方面對上述PCR系統(tǒng)進行了優(yōu)化.優(yōu)化體系為:50mM KCl;10mM Tris-HCl;0.1％TritonX-100;2.0mM MgCl<,2>;0.25mM/dNTP;3U Taq DNA聚合酶;每條引物20pM.共50循環(huán),前20個退火溫度為53℃,后30個為54℃,反應(yīng)體積50ul.其準確率和靈

4、敏度分別為100％(60/60)和10pg DNA.該擴增體系優(yōu)點在于選用一對引物,準確、靈敏、快速,適宜做牛胚胎性別鑒定試劑盒.3、對日本產(chǎn)品LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法牛胚胎性別鑒定試劑盒進行了評價研究.運用該試劑盒在實驗室及現(xiàn)場鑒定胚胎性別,準確率為100％(30/30),靈敏度為1pg,現(xiàn)場移植符合率為3/3,具有快速、準確、靈敏、易檢測等優(yōu)點.不足之處是在高濃度模板