1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌.該研究將用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外膜脂蛋白純化后免疫新西蘭白兔,收集高免血清作為一抗,用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗,建立了間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect fl

2、uorescent assay,IFA).同時(shí)從高免血清中提純IgG再標(biāo)記FITC,作為熒光抗體,建立了直接熒光抗體試驗(yàn)(Direct fluorescent assay,FA).這兩種試驗(yàn)分別對(duì)血清1-13型APP標(biāo)準(zhǔn)株均出現(xiàn)熒光信號(hào),而血清15型APP標(biāo)準(zhǔn)株、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌和鏈球菌等其它相關(guān)細(xì)菌不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng).IFA和FA對(duì)APP的最小檢出濃度分別為10<'4>CFU

3、/ml和10<'5>CFU/ml.多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)由于具有敏感快速的優(yōu)點(diǎn),已被成功應(yīng)用于許多病原的快速檢測(cè)和疾病診斷中.該研究中設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物,以毒素Ⅳ基因(apxⅣ)為擴(kuò)增的目的基因,利用胸膜肺炎放線桿菌血清1型標(biāo)準(zhǔn)菌株為模板,經(jīng)過(guò)模板制備方法和反應(yīng)條件的篩選,建立了胸膜肺炎放線桿菌的PCR檢測(cè)方法.該方法能從胸膜肺炎放線桿菌13個(gè)血清型(1-13型)中擴(kuò)增出預(yù)期的apxⅣ

4、基因中大小為422bp的片段;胸膜肺炎放線桿菌血清型15型、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌和鏈球菌擴(kuò)增結(jié)果為陰性.對(duì)APP的最低檢出濃度是1.29×10<'2>CFU/ml.重復(fù)性試驗(yàn)說(shuō)明,該方法重現(xiàn)性好.對(duì)人工感染動(dòng)物和139份臨床送檢病料進(jìn)行檢測(cè),并與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較.實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物樣品細(xì)菌分離為陽(yáng)性,同時(shí)用上述3種方法檢測(cè)也為陽(yáng)性,有較好的一致性;臨床可疑病料中,有36(25.

5、90﹪)株為IFA陽(yáng)性,29(20.86﹪)株為FA陽(yáng)性,42(30.22﹪)株為PCR陽(yáng)性,從7份病料中分離到該病原.這些初步研究結(jié)果表明,所建立的熒光抗體試驗(yàn)和PCR診斷方法可以應(yīng)用于胸膜肺炎放線桿菌感染的檢測(cè),在檢出率方面優(yōu)于細(xì)菌分離鑒定方法.ApxⅣ基因是新報(bào)道的毒力相關(guān)基因,僅在感染動(dòng)物體內(nèi)表達(dá),具有潛在診斷意義.而且,其與該病原毒力的相關(guān)性尚未闡明.該研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得了