1、胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆、表達(dá)及免疫原性研究,研 究 生： 富 亮　　　　　　　　　　　　　　　　　 指導(dǎo)教師： 趙玉軍 教授 徐福洲 博士 專業(yè)名稱： 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研究方向： 動(dòng)物傳染病學(xué) 所在學(xué)院： 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆、表達(dá)及免疫原性

2、研究,第一章 前 言,第二章 apxⅠA基因的克隆與原核表達(dá),第三章 apxⅠA表達(dá)蛋白的免疫原性研究,豬傳染性胸膜肺炎概況,豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的豬的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺臟廣泛的纖維素性滲出、壞死、出血、胸膜粘連，中性細(xì)胞、淋

3、巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的浸潤，血管栓塞，纖維素沉積等。各種年齡豬對(duì)該病均易感，新疫區(qū)常急性爆發(fā)，急性感染尤其是24～25日齡仔豬感染后表現(xiàn)出極高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病仔豬迅速死亡，死亡率達(dá)到20％以上，最急性型可達(dá)80％～100 ％ ，并且長期帶菌而成為傳染性胸膜肺炎再次爆發(fā)和流行的潛在傳染源，給本病的控制和根除帶來困難。同時(shí)本病在臨床上常與副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒等混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病

4、是國際上公認(rèn)的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一。,胸膜肺炎放線桿菌概述,胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae APP），屬于巴氏桿菌科（Pasteurellaceae）放線桿菌屬（Actinobacillus）。APP是一種革蘭氏陰性小球桿菌，有莢膜，有菌毛，不形成芽胞，無運(yùn)動(dòng)性，最近還發(fā)現(xiàn)該菌有鞭毛。胸膜肺炎放線桿菌分兩個(gè)生物型，即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ni

5、cotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）依賴型，生物Ⅱ型為非NAD依賴型。血清型是根據(jù)APP表面莢膜和脂多糖抗原性的不同來劃分的，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15種血清型，1型-12型、15型屬于生物Ⅰ型，13、14型屬于生物Ⅱ型。,APP菌體形態(tài)（G－）,APP主要毒力因子,溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）莢膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白（Tbp）粘附素,溶血外毒素 （

6、Apx毒素）,APP產(chǎn)生的溶血外毒素Apx被認(rèn)為是APP最重要的毒力因子。在APP的15個(gè)血清型中，目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生四種不同的溶血毒素（Repeats in the structural toxin，RTX），稱為Apx（Actinobacillus pleuropneumoniae- RTX-toxin，Apx），即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。,ApxⅠ的毒性最強(qiáng)，表觀分子量為105-110kDa，具有很強(qiáng)的溶血活性和細(xì)胞毒

7、性作用，分泌ApxⅠ的血清型有1、5、9、10和11。毒素Ⅰ型的操縱子包括：毒素激活基因apxⅠC，毒素結(jié)構(gòu)蛋白基因apxⅠA，兩個(gè)分泌基因apxⅠB和apxⅠD，其中apxⅠC負(fù)責(zé)編碼毒素激活蛋白，apxⅠA編碼毒素結(jié)構(gòu)蛋白，apxⅠB和apxⅠD與毒素的分泌有關(guān)。 apxⅠA基因的N端疏水區(qū)是ApxⅠ的免疫原區(qū)， apxⅠA基因的C端是Ca2+結(jié)合區(qū)只對(duì)毒素發(fā)揮毒性產(chǎn)生作用。,ApxⅡ毒素的表觀分子量為103kDa～105 kDa，

8、除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。ApxⅡ具有弱的溶血活性，它對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞也有細(xì)胞毒性作用。,ApxⅢ毒素的表觀分子量為120 kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，ApxⅢ沒有溶血活性，但對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。,ApxⅣ毒素是新近發(fā)現(xiàn)的。研究人員發(fā)現(xiàn)任何血清型都能在體內(nèi)分泌ApxⅣ毒素蛋白，但體外培養(yǎng)的細(xì)菌卻不能分泌該毒素。當(dāng)apxⅣA與表達(dá)載體上的開放閱讀框1（ORF

9、1）在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，它有微弱的溶血活性和協(xié)同溶血作用（cAMP）。,不同Apx毒素的生物學(xué)特性,,Apx操縱子基本結(jié)構(gòu),,,毒素分泌基因,胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆與原核表達(dá),技術(shù)路線：,apxⅠA基因的克隆與測(cè)序,,重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定,,誘導(dǎo)表達(dá),,誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,,,,,PCR鑒定,雙酶切鑒定,Western Blotting,,,,,,,不同時(shí)間,不同IPTG濃度,不同溫度,,apxⅠA基因的擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)

10、,參照GenBank中apxⅠA核酸序列（D16582），應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，其上下游引物中分別含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增長度為3158bp，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G下游引物：AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC AT,apxⅠA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8

11、%瓊脂糖凝膠電泳顯示大小約為3.2kb，與預(yù)期大小一致 。,,重組質(zhì)粒pTA的PCR和酶切鑒定結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pTA進(jìn)行PCR和酶切鑒定：PCR擴(kuò)增出約3.2kb的目的條帶；EcoRI和 XhoI雙酶切后切出大小分別為3.0kb和3.2kb的兩條帶，結(jié)果表明目的片段已克隆到質(zhì)粒載體上。,,目的片段序列測(cè)定,pTA的測(cè)序結(jié)果與GenBank中發(fā)表的APP標(biāo)準(zhǔn)10型apxⅠA基因（D16582） 進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，兩端的同源性分別為

12、99.4%和99.6%。表明apxⅠA基因已經(jīng)成功克隆到pGEM-T easy vector克隆載體 中。,重組表達(dá)質(zhì)粒pETA的PCR和酶切鑒定結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pETA進(jìn)行PCR和酶切鑒定：PCR擴(kuò)增出約3.2kb的目的條帶； EcoRI和 XhoI雙酶切后出現(xiàn)5.9kb的空載體和3.2kb的插入片段兩條帶。鑒定結(jié)果表明目的片段以正確方向插入原核表達(dá)載體pET-32a中。,,不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖,,,含有重組質(zhì)

13、粒的BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可表達(dá)一相對(duì)分子量約120kDa的融合蛋白，與實(shí)際預(yù)測(cè)大小相符，不同誘導(dǎo)時(shí)間顯示誘導(dǎo)后5～6h表達(dá)量最高。,不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖,,將不同IPTG濃度誘導(dǎo)的樣品進(jìn)行SDS-PAGE ，結(jié)果表明，IPTG濃度為0.6mmol/L的蛋白表達(dá)量最高。,不同溫度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖,,將不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的樣品進(jìn)行SDS-PAGE ，結(jié)果表明，在25℃條件

14、下表達(dá)的蛋白表達(dá)量最高。,重組質(zhì)粒pETA表達(dá)產(chǎn)物Western blotting檢測(cè)結(jié)果,,表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用兔胸膜肺炎放線桿菌免疫血清作一抗，羊抗兔IgG作二抗進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果可見一條特異性的抗原抗體結(jié)合帶，分子量大小與目的蛋白相同，從而證明表達(dá)的目的蛋白是apxⅠA蛋白。,,,裂解后SDS-PAGE電泳圖,,超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE：經(jīng)超聲波裂解后離心，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-P

15、AGE。結(jié)果表明，目的蛋白在沉淀物中，故可判定目的蛋白以包涵體形式存在。,apxⅠA表達(dá)蛋白的免疫原性研究,技術(shù)路線：,三種表達(dá)蛋白的純化及Western blotting分析,,天然ApxⅠ毒素蛋白的提取,,免疫原濃度的測(cè)定與免疫小鼠,,用間接ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠的抗體水平,,APP1型菌和APP10型菌半數(shù)致死量（LD50）的確定與攻毒,三種蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖,,純化后的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE，結(jié)果如

16、圖所示，三種蛋白的大小分別為120kDa、58kDa、79kDa。純化后比較顯示雜帶減少，表明純化效果良好。,三種蛋白的Western blotting檢測(cè)結(jié)果,,用APP10型菌免疫兔的陽性血清作一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作二抗，進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果如圖所示，三種蛋白都與陽性血清反應(yīng)，說明都具有免疫原性。,,,,APP10型菌所提取的天然ApxⅠ,,經(jīng)過SDS-PAGE，如圖所示，用飽和硫酸氨（（NH4

17、）2SO4）沉淀法提取天然ApxI毒素蛋白的大小為105～110kDa。,免疫原濃度的測(cè)定結(jié)果,,經(jīng)BCATMProtein Assay Kit測(cè)得apxⅠA表達(dá)蛋白濃度為2.5mg/ml、apxⅠAN表達(dá)蛋白濃度為3mg/ml、apxⅠAC表達(dá)蛋白濃度為2.4mg/ml、提純的天然ApxⅠ毒素蛋白濃度為5 mg/ml。,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組,免疫程序與劑量,將提取的天然ApxⅠ毒素蛋白和三種表達(dá)蛋白乳化后分別免疫小鼠，共免疫三次，每次間隔兩周

18、。 一免：將純化的三種表達(dá)蛋白與提純的天然ApxⅠ毒素用PBS稀釋，與等量的弗氏完全佐劑乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白100µg，進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。 二免：將四種蛋白用PBS稀釋，與等量的弗氏不完全佐劑乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白150µg，進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。 三免：將四種蛋白用PBS稀釋，與等量的弗氏不完全佐劑乳化制成疫苗，每0.2ml

19、疫苗中含有蛋白200µg，進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。 對(duì)照組用PBS與等量佐劑乳化后，對(duì)小鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。,小鼠免疫后的抗體效價(jià),,APP10型半數(shù)致死量（LD50）的確定,根據(jù)事先估計(jì)10型和1型的LD50，我們分別利用三個(gè)梯度的10型菌和1型菌對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒。,APP10型菌小鼠腹腔攻毒結(jié)果,根據(jù)攻毒結(jié)果，我們確定APP10型菌的半數(shù)致死量（LD50）約為4×106CFU。,注：分子為

20、存活小鼠數(shù);分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。,APP1型半數(shù)致死量（LD50）的確定,APP1型菌小鼠腹腔攻毒結(jié)果,注：分子為存活小鼠數(shù)；分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。,根據(jù)攻毒結(jié)果，我們確定APP1型菌的半數(shù)致死量（LD50）約為1×106CFU。,攻毒結(jié)果,注：分子為存活小鼠數(shù)；分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。,三免十天后試驗(yàn)組和對(duì)照組分別用APP10型菌和APP1型菌5×LD50的劑量進(jìn)行攻毒。24h內(nèi)觀察小鼠死亡情況及狀態(tài)。,結(jié) 論,1.本試驗(yàn)

21、成功的從胸膜肺炎放線桿菌血清10型基因組DNA中擴(kuò)增出了編碼ApxⅠ毒素結(jié)構(gòu)蛋白的apxⅠA基因，經(jīng)克隆測(cè)序顯示其長度為3158bp。與GenBank中發(fā)表的APP標(biāo)準(zhǔn)10型apxⅠA基因（D16582） 進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明同源性達(dá)到了99.4%以上。 2.apxⅠA基因在原核表達(dá)載體pET-32a中進(jìn)行了高效融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為120kDa，最終確定的理想誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為25℃、IPTG濃度為0