1、在轉(zhuǎn)基因植物檢測和基因拷貝數(shù)測定中往往需要使用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因.Lectin和Zein基因已經(jīng)被證實可用于轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的檢測,但適于轉(zhuǎn)基因水稻外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因以及利用熒光定量PCR方法檢測外源基因拷貝數(shù)目前尚未見相關(guān)報道.本論文內(nèi)容分為適合于轉(zhuǎn)基因水稻外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的確定和利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)兩部分.首先,通過生物信息學(xué)分析,選擇蔗糖磷酸化合成酶(sucrose phosphat

2、e synthase,SPS)基因作為候選的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因.利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 2.0軟件設(shè)計其特異性的引物和探針并建立相應(yīng)的定性定量PCR反應(yīng)體系.定性定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明在15個不同的水稻品種中均能擴增得到相同的SPS片段,而在其他常見植物例如向日葵、番茄、茄子、煙草、辣椒、劍麻、大豆、綠豆、大麥、小麥、玉米、油菜、擬南芥、楊梅和胡蘿卜中均未擴增得到相應(yīng)的SPS片段.South

3、ern雜交結(jié)果表明該SPS在不同的水稻品種中均為單拷貝基因.研究結(jié)果表明該SPS基因具有種內(nèi)非特異性、種間特異性以及單拷貝的特點,可以作為轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因定性、定量PCR檢測及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因.靈敏度分析結(jié)果表明本研究建立的SPS定性、定量PCR檢測方法可分別檢測到0.05ng(100拷貝)和0.005ng(10拷貝)的水稻基因組DNA,完全適合于對轉(zhuǎn)基因水稻進行定性和定量檢測.其次,在上述研究的基礎(chǔ)上,利用軟件設(shè)計了針對轉(zhuǎn)基

4、因水稻中外源β-半乳糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphortransferase,HPT)基因的定量PCR檢測引物和探針,并建立了相應(yīng)的定量PCR反應(yīng)體系.該定量體系的檢測靈敏度為10拷貝,與水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)SPS基因定量PCR檢測靈敏度相近.利用本研究建立的SPS、GUS和HPT基因的定量PCR檢測體系,對26個同時含有GUS和HPT基因的轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因GUS、