1、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人巨細(xì)胞病毒UL122、UL54基因體外表達(dá)的研究姓名：段群軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：尚世強(qiáng)張澤偉20100401浙江人學(xué)博十學(xué)位論文中文摘要AD293細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和倒置熒光顯微鏡從mRNA和蛋白質(zhì)水平篩選出理想、高效的siRNA作用靶位。(4)慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：參照上述篩選出的高效siRNA作用靶位，構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的慢病毒載

2、體，并將此慢病毒載體和融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用流式和WesternBlot法檢測(cè)shRNA的慢病毒表達(dá)載體對(duì)HCMV目標(biāo)基因體外表達(dá)的抑制作用。結(jié)果(1)本研究成功構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體pULl22EGFP和pUL54EGFP，實(shí)現(xiàn)ULl22基因和UL54基因的體外表達(dá)。該融合蛋白表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)均能表達(dá)綠色熒光，但是轉(zhuǎn)染后48小時(shí)表達(dá)的綠色熒光明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)表達(dá)的綠色熒光。(2)成功將d段設(shè)計(jì)合成好的、具

3、有形成shRNA能力的DNA序列插入pAVU627質(zhì)粒載體U6啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建成具有表達(dá)shRNA能力的重組質(zhì)粒載體，分別命名為psiULl221、psiULl222、psiULl22—3、psiUL541、psiUL542和psiUL54—3。(3)將融合蛋白表達(dá)載體pULl22EGFP分別與shRNA表達(dá)載體psiULl22—1、psiULl22—2和psiULl223共轉(zhuǎn)染。倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24h重組質(zhì)粒載體psiUL

4、l22一l、psiULl222和psiULl22—3對(duì)融合蛋白的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，轉(zhuǎn)染后48hpsiULl221和psiULl22—2對(duì)融合蛋白熒光表達(dá)具有明顯抑制作用，而psiULl223對(duì)融合蛋白熒光表達(dá)只有輕度抑制作用流式(FCM)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后48hpsiULl22一l、psiULl222和psiULl22—3對(duì)融合蛋白的抑制率分別為820a：10％、79525％和53525％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)，且ps