1、青花萊高 須再生承 統(tǒng)的建立及幾丁質(zhì)疇基因的轉(zhuǎn)化研究 9 6 6 7青花菜高頻再生系統(tǒng)的建立 及幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)化研究研 究 生: 杭曉明指導(dǎo)教師: 王關(guān)林專 業(yè) : 植物學(xué)研 究 方 向 : 植物基因工程中文摘要以 青花菜為材料. 在附 加不同激素的M S 塞本培養(yǎng)塞土直接誘導(dǎo)不走芽分化及植株再生， 建立了青花菜組織培養(yǎng)高頻再生系統(tǒng)。再用根癌農(nóng)桿茵L B A 4 4 0 4 ( p B I 2 1 2 . 2 ) 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化. 將幾

2、丁質(zhì)酶( C h i t i n a s e ) 墓因 導(dǎo)入青 花菜栽培品種中 ， 并 在篩 選培 養(yǎng)墓中 進(jìn) 行篩選， 獲得轉(zhuǎn) 化植 株。 轉(zhuǎn) 化植株 在含K m抗性的 培養(yǎng) 墓中 能 夠生 長(zhǎng)、 分化及生 根， 點(diǎn) 雜交的 結(jié) 果初步 證明 外源 荃因已 整合到植物 荃因組中。關(guān)鍵詞: 根痛農(nóng)桿菌 青花菜 兒丁質(zhì)酶墓因 荃因轉(zhuǎn)化1 前 言近十幾 年來(lái). 由 于 分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)的 迅速發(fā)展 利用D N A重組技 術(shù)可使性狀

3、在種間 轉(zhuǎn)移. 且不會(huì)帶給受體植物不良 農(nóng)藝性狀。 現(xiàn)已 可將動(dòng)物、 植物、 微生物的基因相 互轉(zhuǎn)移， 開辟了 培育植物優(yōu)良 品 種的 新途徑。目 前， 國(guó)內(nèi) 外 科學(xué)家利用 轉(zhuǎn)基因 技術(shù)在培育伉病、 抗蟲、 抗逆及提高農(nóng)作物品質(zhì)等方面進(jìn)行了許多積極有益的研究， 已形成了 從植物基因的分離、 表達(dá)載體的構(gòu)建、 細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的組織培養(yǎng)和植株再生， 以及外源基因的表達(dá)、 檢測(cè)等相當(dāng)成熟的實(shí)驗(yàn)流程， 并已獲得了 百余種轉(zhuǎn)基因植物

4、( 王關(guān)林，1 9 9 8 )1 . 1 植物抗真菌荃因 工程進(jìn)展所 有高等植物均受多 種真菌的 侵害， 真菌病害是世界范圍內(nèi) 危害作物產(chǎn) 量的主要因素之一。 長(zhǎng)期以來(lái)， 對(duì)作物真菌病害的防治辦法主要包括傳統(tǒng)育種、 化學(xué)試劑殺菌法和其它 措失， 如輪作等， 但 均未取得 理想 效果。 隨著 分子生物學(xué)技術(shù)的 迅速 發(fā)展， 國(guó)內(nèi) 外科 學(xué)家 已 克隆出 多個(gè)抗真菌病荃因， 并已 獲得轉(zhuǎn)基因 抗性植株。 這 些抗真菌 病基因 包括能降解真菌

5、細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)酶基因， P -1 , s -葡聚搪酶基因( Q u n z h u , 1 9 9 1 ) ， 阻礙真菌蛋白質(zhì)合成的核糖體失活蛋白基因( S t i r p e , 1 9 9 2 ) ， 破壞真菌細(xì)胞膜的滲透蛋白基因( Wh o l e s h u k ,1 9 9 1 ) , 能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的玉米 H MI 基因( l o h a l , 1 9 9 2 ) 和番茄 C f -9基因Q o n e s ,

6、1 9 9 4 ) , 能抑制真菌在植株里生長(zhǎng)的蛋白酶抑制劑基因( T o u b a r t , 1 9 9 2 ) 等等。 下面一 1 一青花萊高頻再生系 統(tǒng)的建立及幾丁質(zhì)疇墓因的轉(zhuǎn)化研究等( 1 9 9 1 年) 發(fā)現(xiàn)了 煙草中一種 鹽脅迫誘導(dǎo)滲 透蛋白， 通過(guò)對(duì) 編碼該蛋白 基因的修飾， 促 使其 在細(xì)胞外合 成. 達(dá)到直 接殺菌的效 果。 我國(guó)的 舒群芳等也已 成功地 克隆了 編碼天麻抗真菌蛋白的基因。 基因重組和轉(zhuǎn)化工作正在

7、進(jìn)行.1 . 1 . 2 . 2 導(dǎo)入作 物自 身的真菌抗 性基因植物通 常在病原菌浸 染的 點(diǎn)、 區(qū)域產(chǎn)生過(guò) 敏反應(yīng)( h y p e r s e n s i t i v e r e a c t i o n ) ， 表現(xiàn)為 保護(hù) 性的 細(xì)胞自 殺， 大量合成一些與杭病有關(guān)的 植保素、 木質(zhì)素、 細(xì)胞壁強(qiáng)化蛋白 等， 形成壞死 斑， 包圍病原菌， 阻止其蔓延。 通過(guò)采用轉(zhuǎn) 座子標(biāo)記法和 根據(jù)圖譜克隆技術(shù)等手 段， 可分離出 與小種—

8、品種特異反應(yīng)有關(guān)的抗性基因 或無(wú)毒荃因， 導(dǎo)入植物體， 通過(guò)與植物體內(nèi)特定受體結(jié)合， 激活其一系列防衛(wèi)荃因的表達(dá)， 進(jìn)而產(chǎn)生抗病性. 目 前， 已 從細(xì)胞和真菌中克隆到了十幾個(gè)功能已 知的無(wú)毒基因， 如A V r 9 , A V r 4 , A V r d 和C p 等( v a n k a n J A L , 1 9 9 1 ) . J o n e s 等( 1 9 9 4 年) 已 用 轉(zhuǎn)座 子標(biāo) 記法成功 地從番茄中 分 離

9、出C f 9 基因。1 . 1 . 2 . 3 抗真菌次生代謝產(chǎn) 物的 基因 控制一般來(lái)說(shuō)， 不同的植物產(chǎn)生不同的抗菌化合物， 即抗毒素。 病原菌對(duì)非寄主植 物產(chǎn)生的抗毒素敏感性較強(qiáng). 因此將一種植物的抗毒素 基因 導(dǎo)入另一種植物中 去， 可增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性。 在許多植物中已發(fā) 現(xiàn)抗毒素的濃度與特定病原菌的抗性之間有相關(guān)性， 可應(yīng)用抗毒素的代謝途徑和抑菌機(jī)理， 將抗毒索基因 應(yīng)用于真菌 病的防治。1 . 1 . 2 . 4 轉(zhuǎn)真

10、菌酶 抑制物基因病原真菌侵染植物時(shí)， 產(chǎn)生內(nèi) 源多聚半乳糖醛酸酶( e n d o p o l y g a l a c t u r o n a s e ) 分解植 物細(xì) 胞壁， 形成低聚半乳糖醛酸( o l i g o g a l a c t u r o n i d e s ) 。 當(dāng) 此降 解產(chǎn)物 較少時(shí)， 不能起到植物防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)物的作用， 但當(dāng)抑制物存在時(shí). 可抑制多聚半乳糖醛酸的水解 從而較多的低聚半乳糖醛酸的存在可以充當(dāng)誘導(dǎo)

11、物， 引起防衛(wèi)反應(yīng)。由 此可見(jiàn)， 抑制劑蛋白在植物抗病原真菌中起重要作用。 T o u b a r t 等( 1 9 9 2 年) 分離克隆了 編碼菜豆抑制多聚半乳塘醛酶的基因， 用于抗真菌轉(zhuǎn)基因植物的研究中。1 . 1 . 2 . 5 降 解真菌產(chǎn) 生的 毒素的 酶基因有些病原真菌侵染植物的致病機(jī)理是產(chǎn)生毒素來(lái)殺死被感染的細(xì)胞， 如玉米枯萎病就是由于病原真菌產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞所致。 Mo f f a t ( 1 9 9 2 年) 報(bào)導(dǎo)

12、已克隆到編碼降解枯萎病真菌產(chǎn)生的毒紊的一種酶基因， 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)玉米枯萎病顯示抗性。綜上所述， 植物病原菌具有多種致病手段， 而植物的防衛(wèi)機(jī)制也是多方面的。 通過(guò)基 因 工程的方法， 可 使植物獲得 抑制 或削 弱病 原菌 部分 致病因 子的能 力， 或增強(qiáng)某 些防 衛(wèi)反應(yīng)的作用， 從而獲得具有部分抗性的植物。1 . 2 十 字花科植物轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展1 . 2 . 1 目 前獲得轉(zhuǎn)基因 植株的 轉(zhuǎn)化受體十字花科植物的轉(zhuǎn)化受體主要是直接取

13、自植物的組織塊， 包括無(wú)菌苗的下胚軸、 子葉、 葉、 根和發(fā)芽種子等， 以 及大田植株花莖的 切段和薄層細(xì)胞。 其優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)行轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)便、 快 速。 缺點(diǎn) 是: ( 1 ) 它們 是多細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 再生 植 株可能是嵌合體， 但可 通過(guò)原生 質(zhì)體 轉(zhuǎn)化 解決。 現(xiàn)已 從甘蘭型油菜. 黑芥的原生質(zhì)體獲得了再生轉(zhuǎn)基因 植株。( 2 ) 通常這些轉(zhuǎn)化受體 是 二 倍體， 因 此轉(zhuǎn)化植 株常為 雜合， 后代 會(huì)發(fā)生 分離。 如果 用 具備了 單 倍性