1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.），屬于無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus Lour.）常綠木本植物，龍眼胚胎發(fā)育的研究對于龍眼的生產(chǎn)具有重要的意義。植物體胚發(fā)育過程是一個復雜的過程，存在著許多代謝途徑和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miRNA作為重要的調(diào)控因子植物體胚發(fā)生過程中一定存在著巨大的作用，與miRNA相互作用的AGO蛋白在龍眼體胚發(fā)生過程中也具有重要的作用。本研究擬通過對AGO家族基因進行克隆

2、，以及熒光定量PCR技術(shù)對龍眼體胚發(fā)生不同階段以及四季密龍眼不同組織的中AGO基因的表達量進行分析，同時對其亞細胞定位進行研究，為揭示龍眼miRNA調(diào)控分子機制提供新的線索，并為調(diào)控龍眼等木本植物的胚胎發(fā)育提供理論依據(jù)。
　　1龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全長克隆
　　通過對龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組分析和GeneBank中的比對，龍眼胚性愈傷組織中含有5種AGO蛋白，分別為AGO1、AG

3、O2、AGO4、AGO5、AGO6，其中AGO4基因的表達量極低。在此基礎(chǔ)上，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，對AGO1、AGO2、AGO5、AGO6進一步克隆，最終獲得它們的cDNA全長序列：AGO1基因cDNA全長為3529 bp，開放閱讀框為3183 bp，編碼1061個氨基酸,命名為DlAGO1，GeneBank登錄號為KM001869；AGO2基因全長為3128 bp，5端UTR長度為73 bp，3端UTR長度為121 bp，

4、開放閱讀框為2934 bp（含終止子），編碼976個氨基酸，命名為DlAGO2，登錄號為KM001870；AGO5基因的全長為3203 bp，開放閱讀框為2919 bp，編碼972個氨基酸，命名為DlAGO5，登錄號為KM001871；龍眼胚性愈傷組織AGO6基因cDNA的全長序列3168 bp，開放閱讀框（ORF）長為2700 bp，編碼900個氨基酸，命名為DlAGO6，登錄號為KF819529。
　　2龍眼胚性愈傷組織AGO

5、1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息學分析
　　在上述基礎(chǔ)上，利用生物信息學對龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族的基因進行基本理化性質(zhì)、磷酸化位點、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域等進行分析。對龍眼胚性愈傷組織中AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因編碼的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，DLAGO2 PIWI區(qū)域含有DDD結(jié)構(gòu)，DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6含有DDH結(jié)構(gòu)，由此推測龍眼胚性愈傷組織的AGO1、AGO2、AGO5、

6、AGO6蛋白可能具有切割mRNA功能，參與轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。磷酸化位點的預測結(jié)果顯示，DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6蛋白絲氨酸磷酸化位點較多并N、C兩端分布密集，中間部分分布均勻，AGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNA內(nèi)切酶活性，而該蛋白豐富的絲氨酸磷酸化位點，可能為增加該蛋白與小RNA結(jié)合后的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控作用。DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6與擬南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系統(tǒng)進化樹分

7、析，發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織的AGO蛋白可能分為四個分支，并且DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6分別屬于龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白的四個分支。
　　3龍眼體胚發(fā)生過程以及龍眼不同組織器官中AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的表達定量分析
　　用實時熒光定量技術(shù)對AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過程中以及不同組織器官中進行相對定量表達分析。
　　龍眼不同胚性階段的表達情

8、況：在龍眼體胚發(fā)生過程早期，隨著體胚發(fā)生過程的推進，AGO1基因的表達量逐漸升高，在子葉時期的表達量有所降低，整體來看在非胚性階段的時候表達量是最高的；AGO2基因在龍眼的不同胚性階段的表達量具有差異，從整體趨勢來說，相對表達量的趨勢呈M型，在愈傷組織和球形胚時期的表達量是M型的兩個頂點，在非胚性階段、不完全緊實結(jié)構(gòu)以及子葉胚時期表達量相對較低；AGO5基因在龍眼體胚的不同階段的表達具有顯著的差異，整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，隨著體胚發(fā)生

9、過程的推進，AGO5基因的表達逐漸降低，非胚性階段的表達量高于其它胚性階段；AGO6基因在龍眼體胚的不同階段的表達具有顯著的差異，整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，隨著體胚發(fā)生過程的推進，AGO6基因的表達逐漸降低，但非胚性愈傷組織中的表達量相對低很多。
　　龍眼不同組織部位的表達情況：AGO基因在龍眼不同組織部位中的表達具有差異顯著，其中AGO1基因在葉、花蕾、小果、大果、果皮以及種子中的表達量相對較低，在果肉中的相對表達量最高，可能與

10、果肉的形成有關(guān)，另外在成花和根中的相對表達量同樣較高的，因此 AGO1基因可能與花和根的發(fā)育相關(guān)miRNA具有相互作用關(guān)系；AGO2基因在根、葉、花蕾、成花、小果、大果、果肉、種子的表達量相對較低，在果皮內(nèi)的含量很高，推測AGO2基因與果皮的發(fā)育有關(guān)的miRNA具有相互作用。AGO5基因果皮中的表達量顯著高于其他組織部位，這個與AGO2基因相似，可能與AGO2基因有相互作用關(guān)系；AGO5基因在小果中的表達量極低，在大果中表達量也不高，卻

11、在果皮中表達量高，推測可能在果實成熟后期的果皮發(fā)育過程中具有重要作用；AGO6基因成花與果肉的表達最高，在葉、大果、果皮的表達量相對較低，在根和花蕾相對表達量較高，小果和種子的相對表達量高于葉等的組織部位。
　　4龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亞細胞定位分析
　　本研究過程中構(gòu)建了龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6蛋白的亞細胞定位載體，采用了農(nóng)桿菌瞬時表達技術(shù)，于洋蔥表皮細胞

12、中觀察AGO1、AGO2、AGO5和AGO6亞細胞定位熒光信號，結(jié)果顯示，AGO1主要在細胞核和微體中，AGO2主要集中于細胞核和細胞質(zhì)中，AGO5和AGO6主要集中于細胞核和細胞膜上。龍眼胚性愈傷組織AGO 蛋白都定位于細胞核中，細胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及核糖體合成的主要場所，對于細胞周期以及細胞衰老都具有重要功能，AGO蛋白的亞細胞定位的研究，有助于進一步探究基因功能。
　　綜上所述，通過龍眼胚性愈傷組織AGO1、A

13、GO2、AGO5和AGO6基因的序列和生物信息學分析，可以發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族序列保守性較強，是一類保守的堿性蛋白，且龍眼AGO蛋白可以分為與水稻類似的四個分支。AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過程中的差異表達，推測可能與細胞分裂速率有關(guān)，并在四季蜜不同組織中的差異表達，推測其可能參與特定器官的形態(tài)建成。亞細胞定位顯示AGO1、AGO2、AGO5和AGO6均定位于細胞核中。細胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及