1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.)“紅核子”胚性愈傷組織(Embryogenic callus，EC)為材料，對以下8個方面進(jìn)行研究：①龍眼胚性愈傷組織CDC48基因(cell division cycle48) cDNA和DNA克??；②CDC48基因的原核表達(dá)；③龍眼胚性愈傷組織CDC48基因的生物信息學(xué)分析；④龍眼胚性愈傷組織GPX(glutathione peroxidase) cDNA和DNA克隆；⑤

2、GPX基因的原核表達(dá)；⑥龍眼胚性愈傷組織GPX的生物信息學(xué)分析；⑦以龍眼UBQ和EF-1α2個基因共同作為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過程各階段培養(yǎng)物中龍眼CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化；⑧分析龍眼體胚發(fā)生過程各階段培養(yǎng)物及逆境脅迫處理下龍眼EC GPX活性變化。主要研究結(jié)果如下： 1.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因cDNA和DNA全長的獲得 以龍眼EC為材料，應(yīng)用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，獲

3、得了龍眼胚性愈傷組織CDC48的cDNA全長為為2620 bp，其中5UTR為17 bp，3'UTR為187 bp，3’端還含有13個poly(A)尾。該序列與登錄GenBank的其它植物CDC48基因有很高的同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)拼接的cDNA含有一個2415 bp的開放閱讀框，編碼805個氨基酸，ATG為起始密碼子、TAG為終止密碼子。將此基因命名為DLCDC48，并在GenBank上登錄，登錄號為EU606206。從DNA水平克隆也

4、得到了龍眼胚性愈傷組織的CDC48基因，并且經(jīng)測序證實該基因無內(nèi)含子，在GenBank上登錄，登錄號為：FJ590953。 2.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因原核表達(dá) 根據(jù)龍眼EC CDC48全長cDNA的序列分析，在可能的ORF區(qū)域設(shè)計一對添加限制性內(nèi)切酶的特異引物，進(jìn)行ORF片段擴增并將其克隆到表達(dá)載體pET-28 a中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中進(jìn)行融合表達(dá)。經(jīng)過誘導(dǎo)，SDS-PAGE

5、分析發(fā)現(xiàn)宿主菌中有一個分子量約為89 kD的新蛋白出現(xiàn)。該誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子量與理論推導(dǎo)龍眼EC CDC48的分子量89.5 kD相近。 3.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對龍眼胚性愈傷組織CDC48的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：CDC48蛋白的分子量是89564.8 Da，理論等電點pI4.92，是不具跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性胞質(zhì)蛋白，不具有信號肽，主要定位在細(xì)胞核上，有3

6、個區(qū)域最有可能形成卷曲螺旋，由40.87％的a螺旋、15.28％的延伸鏈和43.85％的不規(guī)則卷曲組成，磷酸化位點有39個。保守結(jié)構(gòu)域與功能域分析龍眼CDC48具有兩個典型的ATPase模塊，以及含有CDC48特有的N端。通過功能的預(yù)測與分析，推測與細(xì)胞的分裂有關(guān)系。通過其氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，CDC48的進(jìn)化在一定程度上反應(yīng)了植物的進(jìn)化。此外，還對CDC48酶分子三維立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測和分析。 4.龍眼胚性愈傷組織GP

7、X基因cDNA和DNA全長的獲得 以龍眼EC為材料，應(yīng)用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)，獲得了龍眼胚性愈傷組織GPX的cDNA全長cDNA全長為947 bp，5'UTR為195bp，3'UTR為245 bp，區(qū)域還含有典型的加尾信號AATAA和poly(A)尾。該序列與登錄GenBank的其它植物GPX基因有很高的同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)拼接的cDNA含有一個504 bp的開放閱讀框，編碼168個氨基酸，ATG為起始密碼子、TAA為終止密

8、碼子。將此基因命名為DLGPX，并在GenBank上登錄，登錄號為EU364813。從DNA水平克隆也得到了龍眼胚性愈傷組織的GPX基因，1736 bp核苷酸序列，有ATG起始密碼子和TAA終止密碼子，并在GenBank上登陸，登陸號為：EU680970。通過DNAMAN6.0軟件分析，GPX基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，所有內(nèi)含子的剪切位點均符合真核生物GT-AG規(guī)則。 5.龍眼胚性愈傷組織GPX基因原核表達(dá) 根據(jù)

9、龍眼EC GPX全長cDNA的序列分析，在可能的ORF區(qū)域設(shè)計一對添加限制性內(nèi)切酶的特異引物，進(jìn)行ORF片段擴增并將其克隆到表達(dá)載體pET-28 a中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中進(jìn)行融合表達(dá)。經(jīng)過誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)宿主菌中有一個分子量約為23 kD的新蛋白出現(xiàn)。本研究所用的酶切位點為Sacl和XhoI，把載體上額外翻譯的38個氨基酸一起表達(dá)。龍眼GPX編碼基因產(chǎn)物的理論推導(dǎo)分子量18.54 kD

10、，加上額外翻譯的氨基酸理論推導(dǎo)分子量為4.08 KD(38個氨基酸理論推導(dǎo)分子量為39.45 KD)，總共為22.62KD，與本研究結(jié)果相符。 6.龍眼胚性愈傷組織GPX基因生物信息學(xué)分析 運用生物信息學(xué)軟件對龍眼胚性愈傷組織GPX基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：GPX蛋白的分子量是18541.16Da，理論等電點pI7.18，是不具跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性胞質(zhì)蛋白，不具有信號肽，細(xì)胞主要定位在細(xì)胞質(zhì)上，有1

11、個區(qū)域最有可能形成卷曲螺旋，由27.98％的a螺旋，20.249％的延伸鏈和51.79％的不規(guī)則卷曲組成，磷酸化位點有13個。龍眼胚性愈傷組織GPX氨基酸序列含有PHGPX的兩個特征序列，推測所克隆到的可能是GPXs家族中保護(hù)膜免受損傷的PHGPX的cDNA序列。此外，還對GPX酶分子三維立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測和分析。 7.龍眼胚性愈傷組織CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 用龍眼胚性培養(yǎng)物中UBQ和EF-1α2個基因

12、共同作為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過程各階段培養(yǎng)物龍眼CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化。分析結(jié)果顯示：龍眼CDC48在體胚發(fā)生過程中都有不同程度的表達(dá)，其中胚性緊實球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大，其次是胚性愈傷組織，最低的是球形胚；龍眼GPX在體胚發(fā)生過程中也均有不同程度的表達(dá)，其中胚性緊實球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大，其次是子葉胚，最低的是胚性愈傷組織。 8.龍眼體胚發(fā)生過程中GPX酶活性變化 GPX活

13、性在龍眼體胚發(fā)生過程中也均有不同程度的表達(dá)，其中胚性緊實球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大，其次是子葉胚，最低的是胚性愈傷組織，這與龍眼體胚發(fā)生過程中基因相對定量表達(dá)結(jié)果是一致的；以龍眼胚性細(xì)胞系LC2為材料，研究了在NaCl、光和溫度脅迫下龍眼胚性愈傷組織GPX酶活性的變化規(guī)律。分析結(jié)果顯示：在一定逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)GPX可以起到應(yīng)答外界刺激的作用，且活性呈規(guī)律表達(dá)，推測GPX活性變化與胚性細(xì)胞抗逆性正相關(guān)，是植物在逆境脅迫下防御ROS傷害的主要