1、抗菌脂肽是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及納豆菌(Bacillus natto)等為代表的芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列脂肽類物質(zhì)(通常有 surfactin、iturin、fengycin subtilin和sublancin等),其分子通常以環(huán)脂肽的結(jié)構(gòu)存在?？咕木哂锌咕蜕锉砻婊钚詣┨匦?在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥、化妝品及食品、石油開采和環(huán)境治理等領(lǐng)

2、域有重要的開發(fā)和應(yīng)用前景,已引起廣泛的關(guān)注。
　　液態(tài)發(fā)酵是抗菌脂肽目前發(fā)酵生產(chǎn)廣泛采用的方式,但液態(tài)發(fā)酵存在諸多缺點(diǎn),如發(fā)酵對設(shè)備的高要求,高成本,低產(chǎn)率,且提取純化發(fā)酵液中的產(chǎn)物較難;與液態(tài)發(fā)酵相比固態(tài)發(fā)酵有很多優(yōu)勢,如發(fā)酵基質(zhì)主要是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的的副產(chǎn)物或廢棄物,可以降低生產(chǎn)成本;此外,降低了發(fā)酵設(shè)備要求,發(fā)酵效率和成本都大大降低;而且在生產(chǎn)中還可以避免出現(xiàn)液體發(fā)酵過程中難以解決的泡沫問題,且提取工藝大大簡化,成本低廉。然而,

3、關(guān)于抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵條件控制的研究鮮有報道,而固態(tài)發(fā)酵條件極大地影響抗菌脂肽的產(chǎn)量,因此研究固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的工藝條件至關(guān)重要。此外,目前對抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵中的許多關(guān)鍵技術(shù)問題和參數(shù)還不清楚,更缺乏系統(tǒng)性地描述整個發(fā)酵過程中各個參數(shù)值的變化,從而影響了抗菌脂肽的整體發(fā)酵效率和發(fā)酵的工業(yè)化控制,最終將影響抗菌脂肽高效生產(chǎn)。因而,本研究對抗菌脂肽固體發(fā)酵發(fā)酵動力學(xué)進(jìn)行研究,為系統(tǒng)性地描述整個發(fā)酵過程中各個參數(shù)值的變化,達(dá)到對工業(yè)化生產(chǎn)高效控

4、制提供支撐。
　　近些年來,隨著凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)養(yǎng)殖的快發(fā)展,導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖體系中水環(huán)境的持續(xù)惡化,致使對蝦的發(fā)病率不斷增加,目前水產(chǎn)病害防治的最主要措施之一是飼料中大量添加抗生素?？股氐拇罅渴褂脮?dǎo)致其在對蝦體中的殘留量大大增加,不但降低了對蝦的抗病能力,形成惡性循環(huán),最后經(jīng)直接威脅對蝦產(chǎn)品的安全,對人體的健康也將造成巨大危害。同時對蝦原料的帶菌率嚴(yán)重,對食品的后續(xù)加工安全性造成威脅。因而,

5、源頭食品的安全性成為迫切解決的問題。因此,尋求綠色、環(huán)保、高效的添加劑來替代抗生素成為提高對蝦抗病能力和改善對蝦產(chǎn)品使用安全性研究的熱點(diǎn)。在諸多的抗生素替代物中,作為一種新型的具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、促生長、無殘留、無抗藥性等特點(diǎn)的添加劑,抗菌肽在家禽、家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面均有一定的應(yīng)用。然而,由于抗菌肽的成本高、來源有限,通過基因工程獲得的抗菌肽活性不高等問題,因而找出更為合適的抗生素替代物尤為重要。納豆菌NT-6菌株是本課題組近期分離出的

6、抗菌脂肽高產(chǎn)菌株,通過固體發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量達(dá)到10 g/(kg·發(fā)酵基質(zhì))且具有耐熱性強(qiáng)、pH適應(yīng)范圍廣、抗菌譜廣、溶解性好和安全無毒等特性,因此將抗菌脂肽作為抗生素的替代品添加到飼料中對提高對蝦抗病能力和食用安全性的研究將有廣泛的應(yīng)用前景。本論文的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.網(wǎng)袋固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數(shù)的優(yōu)化
　　通過單因素試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件為甘蔗渣含量15％、料水比5:5、溫度30℃、發(fā)酵時間48h和20目(Φ10cm

7、×40cm)。在此基礎(chǔ)上,初步確定料水比、溫度、接種量為3個主要影響因素。然后借助軟件 Design Expert8進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計,找出了影響網(wǎng)袋發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量的各主要影響因數(shù)的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預(yù)測模型方程。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽預(yù)測值的最大產(chǎn)量8.74 g/kg時對應(yīng)的三個主要因素取值分別為:水料比1.18、溫度29.78℃、接種量5.17%。為了測試該模型的精確性,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)條件下進(jìn)行,抗菌脂肽

8、的產(chǎn)量為8.77 g/kg,和預(yù)測值非常接近。
　　2.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數(shù)的優(yōu)化
　　以相對濕度、通氣量、厚度為3個主要影響因素,借助軟件 Design Expert8進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計,找出了影響薄層發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量的各主要影響因素的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預(yù)測模型方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽預(yù)測值的最高產(chǎn)量達(dá)到10.7552 g/kg,三個主因素取值分別為:相對濕度87.68%、通氣量12.48m3/

9、min、厚度3.11cm。
　　3.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的動力學(xué)研究
　　在抗菌脂肽薄層固態(tài)發(fā)酵過程中,定時測定發(fā)酵體系中生物量、抗菌脂肽的產(chǎn)量和還原糖含量等相關(guān)指標(biāo),通過Origin軟件對數(shù)據(jù)的處理得到相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)和模型方程。得到最佳發(fā)酵時間為48 h,最小生物量 Cx.0=9.56×106 cfu/g,最大生物量Cx.max=3.20×108 cfu/g,最大比生長速率μm=0.16593 h-1,最小抗菌脂肽產(chǎn)量Cp

10、.0=0.61275 g/kg,最大抗菌脂肽產(chǎn)量Cp.max=10.42448 g/kg,最大比生長速率πm=0.14697 h-1,,最初還原糖量 Cs.0=10.41958,b=0.46058。得到的3個動力學(xué)方程皆有高度的擬合度,說明通過它們得到參數(shù)具有可靠性,同時為工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論支持。
　　4.抗菌脂肽對凡納濱對蝦促生長及非特異性免疫指標(biāo)的影響
　　通過將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對

11、照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、150mg/(kg·feed)(A3組)、200mg/(kg·feed)(A4組)的添加量添加到飼料中對對蝦進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽能顯著促進(jìn)對蝦的生長和提高對蝦血清和肝胰腺中 POD、AKP、LZM、T-SOD和T-AOC活性,從而提高對蝦的非特異性免疫能力,最終提高了對蝦的抗病能力,最終確定抗菌脂肽的最佳工作濃度為100 mg/(k

12、g·feed)。
　　抗菌脂肽作為水產(chǎn)飼料添加劑的開發(fā)應(yīng)用,為突破對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的病害防控等制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題,為促進(jìn)水產(chǎn)飼料抗病添加劑的更新?lián)Q代,實(shí)現(xiàn)對蝦養(yǎng)殖的綠色化,在源頭上保障對蝦產(chǎn)品的質(zhì)量安全。
　　5.NT-6抗菌脂肽對凡納濱對蝦養(yǎng)殖源頭弧菌數(shù)的影響
　　通過將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、20

13、0mg/(kg·feed)(A3組)添加到飼料中對對蝦進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn),在對蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境和染菌后分別對水體和蝦體中弧菌數(shù)的檢測以及檢測對蝦在染菌后的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境中實(shí)驗(yàn)組水體和蝦體中的副溶、溶藻弧菌數(shù)均比對照組低且都低于對蝦致病的弧菌數(shù)閾值;在染溶藻弧菌后各個實(shí)驗(yàn)組的水體和蝦體中的溶藻弧菌數(shù)均在弧菌致病數(shù)閾值之上,但各個劑量組中的弧菌數(shù)明顯低于對照組,說明抗菌脂肽可以有效抑制水體、蝦體中的弧菌數(shù)。
　　芽孢