1、萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)作為一種可侵染多種鱗翅目夜蛾科害蟲的環(huán)境友好型蟲生真菌,由于其在害蟲防治方面具有重要的作用,因而受到人們的廣泛關注及重視。蟲生真菌的分生孢子是其作為殺蟲劑的主要有效成分,但萊氏野村菌大量產(chǎn)孢所需的生產(chǎn)條件較為苛刻,限制了該菌的規(guī)模化生產(chǎn)及廣泛應用。因此,我們課題組另辟蹊徑,成功誘導出了一種可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)分生孢子的侵染體結構,即一種具有抗逆性強、耐高溫和耐儲存等優(yōu)點的微菌核。但目前有關萊氏野村菌微

2、菌核的發(fā)育機制尚不清楚,因此本課題組進行了萊氏野村菌微菌核的比較轉錄組分析,以從分子層面探討微菌核的發(fā)育機制,為微菌核的大量生產(chǎn)及研制高效防治夜蛾科害蟲的生物制劑奠定基礎。本研究從以下兩個方面了進行了研究:一是氧脅迫與微菌核發(fā)育之間的關系;二是在比較轉錄組分析的基礎上,克隆得到了一個與微菌核發(fā)育相關的基因—NADH氧化酶基因Nox,并采用RNA干擾技術對其進行了功能分析。主要研究結果如下:
　　①通過添加外源氧化劑(H2O2,甲萘

3、醌)和抗氧化劑(抗壞血酸)所分別造成的氧脅迫或抗氧脅迫對微菌核發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)10-7、10-5M H2O2能夠顯著性地促進微菌核的分化,提高其生物量及產(chǎn)量;且1μM甲萘醌也能顯著促進微菌核的分化,提高其產(chǎn)量。而不同濃度的抗壞血酸均能顯著抑制微菌核的分化,尤其是當抗壞血酸添加至0.03g/L時,可完全抑制微菌核的形成。這表明,一定濃度的氧脅迫能夠促進微菌核的分化。
　?、诎麅菻2O2含量測定表明,在微菌核形成初期(MI)時,胞內H

4、2O2含量最高,大約是未分化時期(UD)的3倍。這表明 H2O2在微菌核發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學功能,即較高濃度的活性氧參與了微菌核的分化過程。
　?、鄹鶕?jù)轉錄組上調基因庫中NADH氧化酶的EST序列,通過RACE技術獲得了Nox基因的全長序列,Genbank登錄號為KF425266。Nox基因的cDNA全長為1663bp,其中開放閱讀框為1233bp,編碼410個氨基酸,基因組大小為1788bp,含有2個內含子。生物信息學分析表

5、明,該蛋白理論分子量為44.81kDa,理論等電點為7.12,無信號肽和跨膜結構,定位于線粒體上,并含有一個oldyellow enzyme(OYE)-related FMN binding domain(15-356aa)。同源比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),萊氏野村菌的Nox蛋白與綠僵菌的同源性最高,約為82％;且親緣關系最近。
　　④RT-qPCR表達特性分析表明,Nox在微菌核發(fā)育的各時期均有表達。并在MI時期表達量最高,大約是U

6、D期的5.6倍;隨后降低,這與胞內H2O2含量的變化趨勢大致相同。
　　⑤采用酶抑制劑和RNA干擾技術進行Nox基因的功能分析表明,Nox基因與微菌核的發(fā)育有關。其中采用魚藤酮抑制劑研究發(fā)現(xiàn),40μM和100μM魚藤酮均能顯著抑制微菌核的形成,且100μM魚藤酮使得Nox基因的mRNA表達量下降了約50％。
　?、尥ㄟ^RT-qPCR檢測干擾效率表明,500nM siRNA能夠有效沉默Nox基因的表達,使其mRNA表達量下調了

7、約57％。觀察干擾Nox基因后微菌核的表型,發(fā)現(xiàn)500nM siRNA干擾菌株所產(chǎn)生的微菌核表型發(fā)生了明顯變化,主要表現(xiàn)為:微菌核顆粒的直徑變大、培養(yǎng)液中紫褐色色素消失、菌液黏稠度下降以及微菌核產(chǎn)量顯著性降低,其產(chǎn)量下降了約98.5％。這些結果表明,Nox參與調控萊氏野村菌微菌核的發(fā)育。
　　⑦Nox基因與胞內H2O2的產(chǎn)生有關。500nM siRNA干擾菌株所產(chǎn)生的微菌核胞內H2O2含量下降了約38％。結合上述研究結果,我們初步