1、蟲(chóng)生真菌是一種環(huán)境友好型真菌,在防治農(nóng)林害蟲(chóng)時(shí)有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、無(wú)殘留和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng),人們對(duì)環(huán)境友好型農(nóng)藥的研究也在逐漸加強(qiáng)。萊氏野村菌是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌,在田間能夠侵染多種夜蛾科害蟲(chóng)并引起流行病。萊氏野村菌的有效成分為分生孢子,但是由于其產(chǎn)孢需要苛刻的營(yíng)養(yǎng)和持續(xù)光照,限制了大規(guī)模生產(chǎn)。重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室采用誘導(dǎo)發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)出了微菌核,并對(duì)其的抗逆性和毒力等進(jìn)行研究,證實(shí)微菌核可以代替分

2、生孢子作為有效的活性成分。其后,采用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究微菌核形成的分子機(jī)理,發(fā)現(xiàn)在微菌核形成過(guò)程中伴隨著菌絲的極性生長(zhǎng)和氧脅迫(ROS)的產(chǎn)生。本論文是從比較轉(zhuǎn)錄組上調(diào)表達(dá)的cDNA文庫(kù)中挑取racA與cdc42基因,將其克隆并證明二者參與菌絲的極性生長(zhǎng)和微菌核的形成。主要研究成果:
　　①目標(biāo)基因克隆鑒定:采用SMART RACE RT-PCR技術(shù)獲得racA與cdc42的cDNA和基因組序列,ORF分別為657bp和555bp

3、,各自編碼218和184個(gè)氨基酸;
　?、谀繕?biāo)基因的生物信息學(xué)分析:采用生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),RacA與Cdc42蛋白都有Rho家族所特有的G1-G5 box和兩個(gè)分子開(kāi)關(guān);利用MEGA4.0和ClustalX軟件構(gòu)建多個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)萊氏野村菌的RacA與Cdc42蛋白與蝗綠僵菌的親緣關(guān)系最近;
　?、畚⒕诵纬傻膭?dòng)態(tài)過(guò)程:顯微觀察萊氏野村菌微菌核液體發(fā)酵發(fā)育形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程,發(fā)現(xiàn)在其形成過(guò)程中伴隨著兩

4、態(tài)型(酵母狀細(xì)胞與菌絲型)菌體的轉(zhuǎn)變;微菌核是由極性菌絲纏繞而成;在微菌核成熟的后期,培養(yǎng)瓶里出現(xiàn)二輪菌絲的生長(zhǎng);
　?、苣繕?biāo)基因表達(dá)模式分析:收集各個(gè)時(shí)期的樣品,采用qPCR的方法對(duì)racA、cdc42與NADPH復(fù)合體(noxA和noxR為其主要輔助因子)的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) racA,cdc42與 NADPH復(fù)合體在微菌核形成初期表達(dá)量高,racA與 cdc42在兩態(tài)型菌體轉(zhuǎn)變的時(shí)期表達(dá)量也較高;
　?、輗acA與

5、cdc42的功能驗(yàn)證:為了進(jìn)一步研究racA與cdc42的功能,以egfp干擾菌株為陰性對(duì)照,采用體外RNAi的方法進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組,干擾菌株尤其是雙干擾菌株(racA&cdc42RM)生長(zhǎng)緩慢,菌落變小;racA干擾菌株(racARM)與cdc42干擾菌株(cdc42RM)的兩態(tài)型轉(zhuǎn)變延遲2-3d;產(chǎn)孢時(shí)間延遲,產(chǎn)孢量減少;racARM的孢子變大,菌絲變粗且分枝增多,cdc42RM則與對(duì)照組無(wú)顯著性差異;單干擾菌株的微菌

6、核數(shù)量減少為對(duì)照組的3％-4％,菌液不粘稠;racARM的微菌核形態(tài)小于cdc42RM,但大于對(duì)照組;racA&cdc42RM的菌株生長(zhǎng)遲緩,幾乎處于酵母狀細(xì)胞的菌落狀態(tài),幾乎沒(méi)有孢子(1‰)和微菌核(3‰)產(chǎn)生,且形態(tài)不均一;菌絲粗大且分枝增多;
　?、轗OS檢測(cè):采用氮藍(lán)四唑(NBT)對(duì)各菌株產(chǎn)生的ROS的量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)racARM和cdc42RM產(chǎn)生的ROS的量少于對(duì)照組,在racA&cdc42RM中,幾乎檢測(cè)不到ROS的

7、產(chǎn)生;
　　⑦干擾后基因的表達(dá)模式分析:采用qPCR對(duì)各菌株的noxA與noxR的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)干擾菌株中二者的表達(dá)量都下降;
　?、喽玖y(cè)定:采用點(diǎn)滴接種法(將菌株接種到三齡菜青蟲(chóng)的角質(zhì)層上)對(duì)各菌株的毒力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)干擾菌株的致死率下降,LT50延長(zhǎng);
　?、岣骰蜿P(guān)系的初探:采用qPCR的方法對(duì)racA、cdc42、NOX復(fù)合體以及cdc24之間的關(guān)系進(jìn)行初探,發(fā)現(xiàn)在racARM中,cdc42的表達(dá)量顯著上升

8、;在cdc42RM中,racA的表達(dá)量顯著下降;干擾菌株中noxA與noxR的表達(dá)量都下降,但cdc42RM中的下降程度大于racARM,雙干擾菌株中的表達(dá)量最少;racARM與cdc42RM中的cdc24的表達(dá)量都顯著上升。
　　結(jié)論:克隆得到萊氏野村菌的racA與cdc42,二者功能有部分重疊,比如影響菌絲的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量、微菌核的形成、ROS的產(chǎn)生和毒力;但racA在菌絲的極性生長(zhǎng)中發(fā)揮更重要的作用;racA與cdc42可能通