1、以我國(guó)重要海水肉食性養(yǎng)殖魚(yú)類大黃魚(yú)（Larmichthys crocea）為研究對(duì)象，在海水浮式網(wǎng)箱內(nèi)進(jìn)行攝食生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，以觀測(cè)飼料中脂肪酸水平和組成對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)、脂肪酸組成、免疫力、抗病力及相關(guān)基因表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)上探討飼料脂肪酸調(diào)控大黃魚(yú)免疫力和脂肪酸代謝的分子機(jī)制。本文的研究?jī)?nèi)容和主要研究結(jié)果如下：
　　1.飼料中n-3HUFA對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、抗病力以及刺激隱核蟲(chóng)感染后免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　以初

2、始體重9.79±0.6 g的大黃魚(yú)（Larmichthys crocea）為研究對(duì)象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進(jìn)行為期58d的攝食生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，以探討飼料中n-3HUFA對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、TLR22和MyD88相對(duì)表達(dá)量及抗病力的影響。通過(guò)梯度添加DHA油、EPA油和軟脂酸配制等氮等脂的六種飼料（粗蛋白41.3％，粗脂肪11.7%），使飼料中n-3HUFA的含量依次為：0.15、0.60、0.98、1.3

3、7、1.79和2.25%，并使DHA/EPA固定在2.0左右。實(shí)驗(yàn)期間，將六組飼料分別隨機(jī)投喂三個(gè)網(wǎng)箱的實(shí)驗(yàn)魚(yú)（60尾/箱），每天兩次（05:00和17:00）投喂至表觀飽食狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適中水平n-3HUFA（0.98%）組特定生長(zhǎng)率（SGR）顯著高于對(duì)照組（P<0.05），高水平n-3HUFA（1.37%、1.79%和2.25%）會(huì)對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，但差異不顯著（P>0.05）。頭腎白細(xì)胞NBT陽(yáng)性比例、血清超氧化物歧

4、化酶（SOD）和溶菌酶活性隨著飼料n-3HUFA水平升高具有先上升后下降的趨勢(shì)，其中頭腎白細(xì)胞NBT陽(yáng)性比例和SOD在0.60%組具有最大值，而溶菌酶在1.37%組活性最高。各組間頭腎白細(xì)胞的吞噬活性未見(jiàn)明顯趨勢(shì)及顯著性差異（P>0.05）。海水刺激隱核蟲(chóng)感染3d后，各處理組腎臟TLR22 mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05），而當(dāng)飼料中n-3HUFA含量從0.15%增加至0.98%時(shí),MyD88相對(duì)表達(dá)量顯著升高至2.06

5、，之后隨n-3HUFA水平進(jìn)一步升高顯著降低至1.36（P<0.05）；而感染海水刺激隱核蟲(chóng)13d后，各處理組腎臟MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05），而當(dāng)飼料中n-3HUFA含量從0.15%增加至0.60%時(shí)，腎臟TLR22的相對(duì)表達(dá)量顯著升高至2.17；而當(dāng)n-3HUFA含量從0.60%升高至2.25%時(shí)，腎臟TLR22的相對(duì)表達(dá)量顯著降低至1.11（P<0.05）。肝臟TLR22和MyD88 mRNA相對(duì)表

6、達(dá)量在海水刺激隱核蟲(chóng)感染3d和13d隨n-3HUFA水平升高均有先升高后下降的趨勢(shì)，且表達(dá)量最高值出現(xiàn)在0.98-1.79%范圍內(nèi)。海水刺激隱核蟲(chóng)感染13d后各處理組累計(jì)死亡率具有與非特異性免疫和基因表達(dá)相似的趨勢(shì)，其中0.60%n-3HUFA組累計(jì)死亡率最低，顯著低于除0.98%組之外的各處理組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.60%和0.98%n-3HUFA組大黃魚(yú)具有最佳免疫力和SGR，低水平和適中水平n-3HUFA具有較高非特異性免疫力、TL

7、R22和MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明n-3HUFA可能通過(guò)調(diào)控TLR22和MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量來(lái)影響大黃魚(yú)SGR、免疫力及其抗病力。
　　2.飼料中DHA/EPA對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、抗病力以及刺激隱核蟲(chóng)感染后免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　以初始體重9.79±0.6 g的大黃魚(yú)（Larmichthys crocea）為研究對(duì)象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進(jìn)行為期58d的攝食生長(zhǎng)實(shí)

8、驗(yàn)，以探討飼料中DHA/EPA對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、TLR22和MyD88相對(duì)表達(dá)量及抗病力的影響。以魚(yú)粉、豆粕為主要蛋白源，DHA油、EPA油、ARA油和軟脂酸酯為主要脂肪源配制等氮等脂的五種飼料（粗蛋白41.3%，粗脂肪11.7%），使飼料中DHA/EPA依次為0.61、1.54、2.17、3.04和3.88，且DHA和EPA（n-3HUFA）總量固定在1.08%左右。實(shí)驗(yàn)期間，將五組飼料分別隨機(jī)投喂三個(gè)網(wǎng)箱的實(shí)驗(yàn)魚(yú)（60

9、尾/箱），每天兩次（05:00和17:00）投喂至表觀飽食狀態(tài)。結(jié)果表明，大黃魚(yú)的特定生長(zhǎng)率（SGR）隨 DHA/EPA增大具有先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)DHA/EPA由0.61升高至2.17時(shí)，SGR由2.03%/d顯著升至2.26%/d（P<0.05），當(dāng)該比例進(jìn)一步增大時(shí)，SGR有下降趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。頭腎白細(xì)胞NBT陽(yáng)性比例和血清溶菌酶活性隨著 DHA/EPA升高具有先上升后下降的趨勢(shì)，其中頭腎白細(xì)胞NBT陽(yáng)性比例

10、和血清溶菌酶活性分別在2.17和3.04組具有最大值，且均顯著高于對(duì)照組和比率為3.88組（P<0.05）。但頭腎白細(xì)胞吞噬活性和血清SOD活性在各處理組間未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05）。海水刺激隱核蟲(chóng)感染3d后，各處理組腎臟MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著性差異；當(dāng)飼料中DHA/EPA由0.61升高到2.17時(shí)，腎臟TLR22 mRNA相對(duì)表達(dá)量由1.02顯著升至2.47（P<0.05），之后隨 DHA/EPA的增大降至1.73

11、（P>0.05）；肝臟 MyD88相對(duì)表達(dá)量隨著DHA/EPA的增大具有顯著上升的趨勢(shì)，且DHA/EPA為3.88時(shí)具有最高值，顯著高于比率為0.61、1.54和2.17處理組（P<0.05）；當(dāng)飼料中DHA/EPA由0.61升高到3.04時(shí)，肝臟TLR22 mRNA相對(duì)表達(dá)量由1.00顯著升至1.95（P<0.05），之后隨DHA/EPA的增大降至1.51（P>0.05）。刺激隱核蟲(chóng)感染13d后，各處理組腎臟TLR22和MyD88 m

12、RNA相對(duì)表達(dá)量均未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05）；肝臟TLR22相對(duì)表達(dá)量隨DHA/EPA升高由1.01顯著降低至0.46（P<0.05）；當(dāng)飼料中DHA/EPA由0.61升高到2.17時(shí)，肝臟MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量由1.00顯著升至1.64（P<0.05），之后隨 DHA/EPA的增大降至1.16（P>0.05）。感染刺激隱核蟲(chóng)13d后大黃魚(yú)累計(jì)死亡率隨 DHA/EPA增大具有先降低后下降的趨勢(shì)，DHA/EPA為1.54、2.

13、17和3.04時(shí)累計(jì)死亡率較低，顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHA/EPA在2.17-3.04之間時(shí)，大黃魚(yú)生長(zhǎng)和整體免疫水平最佳，過(guò)高DHA/EPA會(huì)降低SGR、非特異性免疫及抗病力，這可能是通過(guò)影響TLR22和MyD88相對(duì)表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　3.豆油為基礎(chǔ)的飼料中添加共軛亞油酸對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫力、抗氧化能力、脂肪沉積和相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　以初始體重為7.56±0.60g的大黃魚(yú)為研究對(duì)

14、象，通過(guò)攝食生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來(lái)探討飼料中共軛亞油酸對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫力、抗氧化能力、脂肪沉積和相關(guān)基因表達(dá)的影響。通過(guò)梯度添加CLA油，使得飼料中CLA含量依次為0（對(duì)照組）、0.42%、0.83%和1.70%飼料干物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)在海水浮式網(wǎng)箱進(jìn)行，每天兩次投喂，周期為70d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃魚(yú)增重率（WGR）和頭腎巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)隨著飼料中CLA的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)飼料中CLA由0升高至0.42%時(shí)，

15、WGR由499.30%顯著升高至572.52%，之后隨著飼料中CLA的進(jìn)一步升高顯著降至444.21%。吞噬指數(shù)在飼料CLA含量為0.42%時(shí)具有最高值（34.7%），顯著高于對(duì)照組（17.9%）和最高CLA含量組（24.7%）。當(dāng)飼料中CLA由0升高至0.83%時(shí)，頭腎巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)、肝臟過(guò)氧化氫酶（CAT）活力和肝臟總抗氧化力（T-AOC）顯著升高，之后隨著CLA的進(jìn)一步升高顯著下降。其中，呼吸爆發(fā)在0.83%時(shí)最高（0.50），

16、顯著高于對(duì)照組（0.34）和最高CLA組（0.42）。而肝臟丙二醛（MDA）隨著飼料CLA的升高由3.30顯著降至1.66 nmol/mg protein（P<0.05）。魚(yú)體和肌肉脂肪水平隨著飼料中CLA含量的升高而升高（P<0.05）。肝臟和腎臟炎癥相關(guān)的基因（環(huán)氧化酶-2和白細(xì)胞介素β）和腎臟脂肪酸氧化相關(guān)基因（肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和乙酰輔酶A氧化酶）的mRNA表達(dá)量會(huì)隨著飼料中CLA含量的升高而顯著降低。肝臟PPARα和乙酰輔酶A氧

17、化酶的表達(dá)隨著飼料中CLA由0.42%升高至1.70%而顯著降低（P<0.05）。上述結(jié)果表明飼料中CLA能夠顯著影響大黃魚(yú)的生長(zhǎng)、非特異性免疫、抗氧化能力及炎性和脂肪酸氧化相關(guān)的基因表達(dá)，呈現(xiàn)出較為顯著的抗炎、抗氧化效果。這有助于理解CLA在魚(yú)類中的具體生理作用。
　　4.飼料中亞麻酸/亞油酸對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、抗氧化能力和相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，魚(yú)油短缺問(wèn)題日益突出。研究表明，高攝入量的亞油酸

18、（18:2n-6）會(huì)嚴(yán)重影響海水魚(yú)類的生長(zhǎng)和免疫性能的發(fā)揮。然而，目前仍不清楚亞油酸的這種不利影響是否能夠通過(guò)適當(dāng)提高ALA/LA的比例來(lái)消除。本實(shí)驗(yàn)以初始體重9.56±0.60 g的大黃魚(yú)（Larmichthys crocea）為研究對(duì)象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進(jìn)行為期70d的攝食生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，以探討飼料中亞麻酸和亞油酸比例（ALA/LA）對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、抗氧化能力及炎性、脂肪酸氧化和合成相關(guān)基因表達(dá)的

19、影響。對(duì)照組飼料含有30%的魚(yú)粉和9%的魚(yú)油，之后用不同植物油的混合物（亞麻油、葵花油和棕櫚油）替代對(duì)照組中78%的魚(yú)油，使飼料中ALA/LA的比例依次為：0.03、0.45、0.90和1.51。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與魚(yú)油組相比，高攝入量的亞油酸顯著降低了大黃魚(yú)的增重率（WGR）和非特異性免疫力（吞噬指數(shù)、呼吸爆發(fā)和血清溶菌酶活力），然而這種不利影響隨著飼料中ALA/LA的升高至0.45或0.90時(shí)得到完全消除。肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和

20、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力在比例為0.45時(shí)最高，顯著高于最低或最高比例組。肝臟丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)與SOD和CAT活力相反的變化趨勢(shì)，當(dāng)比例為0.90時(shí)魚(yú)體肝臟MDA含量最低，顯著低于對(duì)照組。肝臟、腎臟和肌肉炎性相關(guān)基因（環(huán)氧化酶-2（COX-2），白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞子因子α（TNF-α））、脂肪酸氧化相關(guān)基因（過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α（PPARα），肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶（CPTⅠ）和脂酰CoA氧化酶（ACO））以及脂

21、肪酸合成相關(guān)基因（脂肪酸合酶（FAS），蘋(píng)果酸脫氫酶（ME）和6磷酸葡萄糖脫氫酶（6GPD））相對(duì)mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，但上述基因表達(dá)量在ALA/LA比例為0.45時(shí)顯著降至與對(duì)照組相似的水平。上述結(jié)果表明飼料中ALA/LA能夠顯著影響大黃魚(yú)生長(zhǎng)、非特異性免疫、肝臟抗氧化能力以及炎性、脂肪酸氧化和合成相關(guān)基因表達(dá)，比例過(guò)高或過(guò)低均不利于其生長(zhǎng)、免疫和脂肪酸代謝。ALA雖然不是大黃魚(yú)的必需脂肪酸，但在抗炎和抗氧化方面卻具有與n-3