1、豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一種豬的急性并高度接觸性傳染病，PEDV感染后可導致水樣腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，成年豬很少表現(xiàn)出臨床癥狀。從1976年開始我國就陸續(xù)有PED的報道，自2010年下半年以來，該病的流行強度和流行區(qū)域在不斷的加強和擴大，對哺乳仔豬致死率較高，臨床上與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒和大

2、腸桿菌等疫病較難鑒別診斷，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。本研究將純化的豬流行性腹瀉病毒和N蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，用于PEDV抗體的檢測和血清學調查。此外，利用原核表達系統(tǒng)表達獲得重組蛋白Nsp2，將純化的Nsp2蛋白免疫小鼠，利用淋巴細胞雜交瘤技術制備Nsp2蛋白的單克隆抗體，為PEDV診斷和致病機理的研究奠定基礎。具體內容如下:
　　1.PEDV全病毒抗原間接ELISA檢測方法的建立與初步應用
　　

3、采用差速離心方法獲得純化PEDV，作為包被抗原，建立間接ELISA抗體檢測方法，對各項反應條件進行優(yōu)化，并確定其臨界值，同時進行特異性、敏感性、重復性及符合率試驗，優(yōu)化反應條件為:抗原包被濃度為3μg/ml，包被時間為37℃作用2h，1.5％BSA37℃封閉3h，待檢血清樣品稀釋度為1∶100，作用時間為1h，酶標SPA1∶10，000稀釋，37℃作用30min，抗體臨界值為OD450nm≥0.306判為陽性，OD450nm≤0.268

4、判為陰性，介于二者之間為可疑。該方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟、豬偽狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗體均為陰性，批間和批內重復性試驗較好，對江蘇、上海、浙江、安徽地區(qū)587份豬血清樣品進行檢測，抗體陽性率達60.31％,與TSZ公司的PEDV抗體檢測試劑盒比較，其符合率為91.3％、證明該方法具有較好敏感性、特異性、重復性及符合率，可用于PEDV抗體檢測和流行病學調查。
　　2.PEDVN蛋白間接ELISA檢測方法

5、的建立與初步應用
　　將PEDVN蛋白基因克隆至大腸桿菌表達載體，表達獲得重組N蛋白，SDS-PAGE和Western-blot鑒定結果顯示，該蛋白分子量大小為55KDa，具有良好的反應原性和特異性。采用親和層析純化獲得純化重組N蛋白，作為包被抗原，建立間接ELISA抗體檢測方法，優(yōu)化反應條件為:抗原最佳包被濃度為0.8μg/ml，血清樣品最佳稀釋度為1∶100，包被時間為37℃作用2h后4℃過夜，1％BSA37℃封閉3h，待檢血

6、清作用時間為1h，酶標SPA1∶15，000稀釋，37℃作用45min，抗體臨界值為OD450nm≥0.312判為陽性，OD450nm≤0.265判為陰性，介于二者之間為可疑。該方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟、豬偽狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗體均為陰性，批間和批內重復試驗變異系數(shù)為2.6％～9.3％。對江蘇、上海、浙江、安徽地區(qū)458份豬血清樣品進行檢測，抗體陽性率達69.21％。與TSZ公司的PEDV抗體檢測試劑盒

7、比較，其符合率為89.13％;與建立的豬流行性腹瀉全病毒抗原間接ELISA抗體檢測方法進行符合率比較，符合率為90％，證明該間接ELISA方法可以為PEDV診斷和流行病學調查提供依據(jù)。
　　3.PEDVNsp2基因原核表達與純化及單克隆抗體的制備
　　為表達PEDV非結構蛋白Nsp2，本研究采用PCR方法從PEDV陽性組織病料中擴增Nsp2基因，，將其克隆至pET-32a載體，將鑒定正確的重組質粒轉化到BL21(DE3)感受

8、態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE和Westernblot鑒定，獲得重組蛋白Nsp2大小約50KD。成功構建了重組表達質粒pET-32a-Nsp2，并應用親和層析方法純化了重組Nsp2蛋白;以純化的PEDVNsp2蛋白免疫BALB/c小鼠，運用雜交瘤技術進行融合，通過間接ELISA方法進行篩選，獲得了1株分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為6B6。測其細胞上清效價為1∶3，200，腹水效價為1∶2.048×105;Western